張娜，郭琿，羅靜

（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 1.腎內(nèi)科，2.風(fēng)濕科，山西 太原 030001）

抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎（associated vasculitis, AAV）是一種累及全身小血管的自身免疫性血管炎，其特征為壞死性小血管炎性損傷[1]。近年來，對AAV的發(fā)病機(jī)制研究多集中于CD4+T或CD8+T 細(xì)胞亞群的紊亂對AAV的影響[2-3]，而對CD4-CD8-T 細(xì)胞研究很少。雙陰性T細(xì)胞（double-negativ T cells, DNT）即CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞，是近年新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群，其細(xì)胞表面不表達(dá)CD4分子和CD8分子，可分泌多種細(xì)胞因子，在多種疾病中發(fā)揮作 用[4]。本研究通過檢測AAV患者外周血中DNT細(xì)胞的比例及其胞內(nèi)因子白細(xì)胞介素17（Interleukin-17, IL-17）、白細(xì)胞介素4（Interleukin-4, IL-4）及γ干擾素（Interferon-γ, IFN-γ）的水平，探討DNT在AAV發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月—2018年9月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院就診的50例AAV患者（AAV組）。伯明翰評分＜0分為活動組34例，伯明翰評分=0分為緩解組16例。活動組：男性20例，女性16例；年齡41歲（22～64歲）。緩解組：男性8例，女性6例；年齡43歲（23～66歲）。按照有無腎損害分為腎損害組32例和非腎損害組18例。腎損害組：男性18例，女性14例；年齡42歲（22～66歲）。非腎損害組：男性10例，女性8例；年齡43歲（21～66歲）。腎損害組患者經(jīng)腎穿刺活檢證實(shí)符合AAV腎損害的病理改變。同期招募30例健康志愿者作為對照組。其中，男性17例，女性13例。年齡44歲（20～67歲）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①AAV患者符合2012年美國Chapel Hill共識會議關(guān)于顯微鏡下多血管炎、肉芽腫性血管炎或嗜酸性肉芽腫性多血管炎的定義及分類標(biāo)準(zhǔn)[5]；②患者初次診斷為AAV，未接受糖皮質(zhì)激素及免疫抑制治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重感染疾??；②系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等其他自身免疫性疾??；③血液疾病或最近2個(gè)月輸過血；④惡性腫瘤；⑤重大精神疾病。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)（2016KY007），患者及其家屬簽署知情同意書。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑流式細(xì)胞儀FACS Canto Ⅱ購自美國BD公司，葉綠素（PerCP）標(biāo)記的CD3抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isocyanate, FITC）標(biāo)記的CD4抗體、藻紅蛋白（P-phycoerythrin, PE）標(biāo)記的CD8抗體、別藻藍(lán)素（Allophycocyanin, APC）標(biāo)記的IL-17抗體、PE標(biāo)記的IL-4抗體、FITC標(biāo)記的IFN-γ抗體、APC標(biāo)記的鼠免疫球蛋白G1（Immunoglobulin G, IgG1）同型對照抗體、PE標(biāo)記的兔免疫球蛋白G2b（Immunoglobulin G2b, IgG2b）、k同型對照抗體、FITC標(biāo)記的兔IgG1、k同型對照抗體購自美國BD公司，佛波酯和離子霉素購自美國Sigma公司，溶血素購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)在所有納入患者知情的情況下，采集靜脈血2～3 ml，并使用肝素抗凝，與IMDM培養(yǎng)基按1∶1充分混勻，加入20 ng/ml佛波酯和1μmol/L 離子霉素聯(lián)合刺激；同時(shí)加入2μmol/L蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑進(jìn)行阻斷。充分混合后，在37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。

1.2.3 細(xì)胞染色取100μl全血于流式管中，同時(shí)加入PerCP標(biāo)記的CD3、FITC標(biāo)記的CD4及PE標(biāo)記的CD8抗體各10μl進(jìn)行表面染色，同時(shí)設(shè)置同型對照管，室溫避光孵育20 min。加入1 ml溶血素，孵育10 min，2 ml緩沖液洗滌后1 000 r/min離心5 min棄上清。再于每管加入500μl 4%多聚甲醛進(jìn)行固定，20 min后1 000 r/min離心5 min棄上清，每管分別加入含0.1%皂素的緩沖液2 ml進(jìn)行破膜，10 min后1 000 r/min離心5 min棄上清。之后進(jìn)行胞內(nèi)染色，加入APC標(biāo)記的IL-17、PE標(biāo)記的IL-4及FITC標(biāo)記的IFN-γ抗細(xì)胞因子抗體及相應(yīng)的同型對照抗體各0.1μl，孵育30 min后用2 ml含0.1%皂素的緩沖液洗滌，1 000 r/min離心5 min棄上清。最后每管加入磷酸緩沖鹽溶液2%多聚甲醛重懸細(xì)胞。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測完成染色的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。每一樣品檢測20 000個(gè)細(xì)胞，并使用FlowJo V.7.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4表達(dá)水平比較

活動組、緩解組與對照組DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；活動組及緩解組DNT、IL-17及IFN-γ較對照組高（P＜0.05）；而IL-4較對照組低（P＜0.05）；活動組DNT、IL-17較緩解組高（P＜0.05）；活動組IL-4、IFN-γ與緩解組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 腎損害組與非腎損害組DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比較

腎損害組與非腎損害組DNT、IL-17水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腎損害組DNT、IL-17較非腎損害組高（P＜0.05）；腎損害組與非腎損害組IL-4、IFN-γ比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 AAV患者DNT及胞內(nèi)因子與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

AAV患者DNT與紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）、伯明翰評分、血清肌酐（serum creatinine, Scr）、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體（ANCA）滴度24 h尿蛋白水平呈正相關(guān)（P＜0.05）；IL-17與Scr、24 h尿蛋白呈正相關(guān)（P＜0.05）；而IL-4、IFN-γ與各項(xiàng)臨床指標(biāo)無相關(guān)性（P＞0.05）。見表3。

表1 3組DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比較（±s）

表1 3組DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比較（±s）

組別nDNT/%IL-17/（pg/ml）IFN-γ/（pg/ml）IL-4/（pg/ml）對照組300.953±0.3240.853±0.2421.052±0.3843.025±0.673緩解組162.284±0.4752.244±0.4712.649±0.5561.152±0.712活動組344.537±0.8524.342±1.1832.875±0.6751.256±0.328 F值267.044149.00493.546 97.695 P值0.0000.0000.000 0.000

表2 腎損害組與非腎損害組DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比較（±s）

表2 腎損害組與非腎損害組DNT、IL-17、IFN-γ及IL-4水平比較（±s）

組別nDNT/%IL-17/（pg/ml）IFNγ/（pg/ml）IL-4/（pg/ml）腎損害組324.322±0.8424.842±1.1832.949±0.5562.573±0.857非腎損害組182.153±0.3281.944±0.4713.083±0.6632.594±0.465 t值10.4539.9240.763 0.096 P值0.0000.0000.449 0.924

表3 AAV患者臨床指標(biāo)與DNT及胞內(nèi)因子的相關(guān)性分析

3 討論

AAV是一種自身免疫性疾病，可累及全身的小動脈、小靜脈和毛細(xì)血管，進(jìn)而引起多臟器、多系統(tǒng)損傷，其中腎臟受累率最高[1]。DNT在多種自身免疫性疾病[6]、移植排斥[7]、腫瘤免疫[8]及感染性疾病[9]中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AAV活動組患者外周血DNT水平高于緩解組和對照組，提示DNT細(xì)胞參與AAV的發(fā)病進(jìn)程，并影響疾病的活動度。MARTINA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，DNT在早期急性腎損傷患者的外周血中增加，且沉積于損傷的腎組織中。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)AAV腎損害組DNT水平高于非腎損害組，提示DNT與AAV腎損害有相關(guān)性。

DNT可通過分泌多種胞因子參與疾病進(jìn)程[11]。一般來說，IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌，其能誘導(dǎo)組織中多種炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在炎癥組織中的浸潤，參與AAV的發(fā)病進(jìn)程[12]。CRISPíN等[13]發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，IL-17主要由DNT產(chǎn)生，并沉積于腎組織中，促進(jìn)狼瘡腎炎的發(fā)病進(jìn)程。ALUNNO等[14]發(fā)現(xiàn)，DNT在原發(fā)性干燥綜合征患者外周血中增加，且98%～100% DNT都表達(dá)Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子視黃酸孤兒核受體（RORγt），并分泌大量IL-17。本研究也發(fā)現(xiàn)，AAV活動組患者DNT分泌的IL-17水平較緩解組和對照組升高，且腎損害組較非腎損害組IL17升高，由此猜測DNT可能通過分泌IL-17加重疾病進(jìn)程，參與腎臟的損害。

一般來說，IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可上調(diào)免疫反應(yīng)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤和局部肉芽腫的形成，在AAV發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[15]。IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，能下調(diào)免疫反應(yīng)，維持免疫耐受。FISCHER等[16]發(fā)現(xiàn)，刺激DNT后其分泌的IFN-γ水平是CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的3～4倍；MüLLER等[15]發(fā)現(xiàn)，韋納肉芽腫患者外周血中IFN-γ的水平升高，IL-4降低。本實(shí)驗(yàn)表明，AAV患者外周血DNT分泌的IFN-γ水平升高，IL-4減少，提示DNT可能通過誘導(dǎo)IFN-γ及IL-4分泌紊亂，進(jìn)而促進(jìn)AAV的疾病進(jìn)程，同時(shí)也使免疫反應(yīng)向促炎性細(xì)胞Th1型偏斜。但在活動組與緩解組、腎損害組與非腎損害組的AAV患者中，DNT內(nèi)IL-4、IFN-γ的水平比較無差異，猜測DNT分泌的IL-4和IFN-γ可能只參與AAV發(fā)病的始動過程，而對其疾病活動度和腎功能損害無影響。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，AAV患者DNT與ESR、伯明翰評分呈正相關(guān)，兩者能從整體反映疾病活動度，猜想DNT可影響AAV疾病的活動性。而DNT及其分泌的IL-17與反映腎臟功能的指標(biāo)，如Scr、24 h尿蛋白水平呈正相關(guān)，提示DNT及其分泌的IL-17可能參與AAV患者的腎臟損害，也證實(shí)本文前述的觀點(diǎn)。

綜上所述，DNT在AAV的發(fā)病機(jī)理中起一定作用，且與腎臟損害關(guān)系密切。通過對DNT研究可能對AAV的診斷、疾病活動程度的監(jiān)測以治療提供一定的依據(jù)，但本實(shí)驗(yàn)也有一定的局限性，首先納入病例的數(shù)量相對較少；同時(shí)并未對DNT細(xì)胞的影響機(jī)制進(jìn)行更深入的探討，因此需要后期進(jìn)行更大規(guī)模、更深入的臨床研究。