趙煥東，胥洪鵑，李堅，任彩萍，陳玉祥

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 手術(shù)室，湖南 長沙 410008；2.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 腫瘤研究所，湖南 長沙 410078；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 普外科，湖南 長沙 410008； 4.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，湖南 長沙 410013）

隨著醫(yī)療水平不斷提高，人口老齡化已成為當(dāng)今亟需解決的問題。近年來，衰老機制與抗衰老的研究備受關(guān)注[1]。眾所周知，衰老是一個與氧化應(yīng)激密切相關(guān)而又復(fù)雜的過程，不僅會導(dǎo)致機體形態(tài)學(xué)改變，而且會影響心、腦、肺等器官的功能[2-3]。為提高人們生活質(zhì)量并有效延緩衰老，抗氧化和衰老藥物或食品的研究成為熱點。動物衰老模型的復(fù)制是衰老相關(guān)研究中必然涉及到的內(nèi)容，選擇合適的衰老模型極為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-半乳糖（美國Sigma公司），水合氯醛（北京索萊寶科技有限公司），聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate, BCA）試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）試劑盒及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，組織裂解液、苯甲基磺酰氟購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）抗體（美國Abcam公司），抗β-actin抗體（美國CST公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），增強型化學(xué)發(fā)光液（Electrochemiluminescence, ECL）（蘇州新賽美生物技術(shù)公司）。

1.2 主要儀器

電泳儀（美國Bio-Rad公司），全波長酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），化學(xué)發(fā)光、可見光成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物與分組9周齡C57BL/6J小鼠30只，體重（20±2）g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物公司提供，許可證號：SYXK（湘）2015-0017。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境由中南大學(xué)實驗動物學(xué)部提供，SPF級，溫度25℃，相對濕度60%，12 h晝/夜循環(huán)照明，自由進(jìn)食、飲水。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為3組：500 mg/（kg·d）D-半乳糖組、1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組及對照組。每組10只，每組分2籠飼養(yǎng)，每籠5只。500和1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠分別經(jīng)頸背部皮下注射500和1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖，對照組小鼠按體重經(jīng)頸背部注射0.9%生理鹽水1次/d，持續(xù)8周。本研究所用動物實驗方法通過中南大學(xué)實驗動物學(xué)系的審批。

1.3.2 SOD、GSH-Px、MDA的檢測給藥結(jié)束后，小鼠禁食24 h，經(jīng)水合氯醛麻醉，摘眼球取血，室溫靜置1 h，4℃、12 000 r/min離心分離血清，保存于-20℃。同時取肝、腦組織保存于-80℃?zhèn)溆?。?yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定血清SOD、GSH-Px及MDA。制備肝臟和腦組織勻漿液，4℃、12 000 r/min離心，測定SOD、GSH-PX活性和MDA含量。

1.3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色解剖小鼠時取部分肝臟和腦組織于10%甲醛浸泡，脫水后石蠟包埋，切片，行HE染色，樣品掃描后用Case Viewer軟件 分析。

1.3.4 Western blotting制備肝臟和腦組織勻漿液，4℃、12 000 r/min離心，取上清。采用BCA法測定蛋白濃度，行SDS-PAGE凝膠電泳，將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%牛血清蛋白TBST溶液室溫封閉1 h，相繼孵育一抗（抗HO-1和抗β-actin）和二抗。采用ECL發(fā)光顯色，AlphaView軟件進(jìn)行條帶分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高劑量D-半乳糖誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠發(fā)生形態(tài)學(xué)改變

3組小鼠初始體重比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3組小鼠末次體重比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且3組體重增值均＞7 g（見表1）。小鼠在形態(tài)表現(xiàn)上也有較大差異，從第6周開始，1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠頭頸部陸續(xù)發(fā)生不同程度的脫毛現(xiàn)象，且隨著干預(yù)時間延長，D-半乳糖組小鼠毛色逐漸泛黃，出現(xiàn)精神萎靡、皮膚彈性變差等（見圖1）。

表1 3組小鼠藥物干預(yù)第1天和最后1天的體重比較（n =10，g，±s）

表1 3組小鼠藥物干預(yù)第1天和最后1天的體重比較（n =10，g，±s）

組別第1天最后1天對照組24.660±0.68030.600±0.758 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組24.700±0.57028.000±0.224 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組24.580±0.61825.240±0.483 F值0.480125.604 P值0.9530.000

2.2 3組小鼠血清、肝臟和腦組織生化指標(biāo)比較

2.2.1 SOD活性3組小鼠血清、肝臟和腦組織SOD活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，500 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠腦組織SOD活性低于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織SOD活性低于對照組（P＜0.05）。

圖1 3組小鼠外觀形態(tài)變化

2.2.2 GSH-Px活性3組小鼠血清、肝臟和腦組織GSH-Px活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗， 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織GSH-Px活性低于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織GSH-Px活性低于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠肝臟GSH-Px活性低于500 mg/（kg·d）D-半乳糖組（P＜0.05）。

2.2.3 MDA含量3組小鼠血清、肝臟和腦組織MDA含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，500 mg/（kg·d） D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織MDA含量高于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清、肝臟和腦組織MDA含量高于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組小鼠血清和肝臟MDA含量高于500 mg/（kg·d）D-半乳糖組（P＜0.05）。見表2～4和圖2。

2.3 肝臟和腦組織HE染色結(jié)果

對照組肝組織切片顯示細(xì)胞核大且圓，肝索排列整齊，細(xì)胞無變性或者壞死，D-半乳糖處理后肝細(xì)胞出現(xiàn)點狀壞死、水腫和空泡樣變性，并且出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，肝索排列排混亂（見圖3A～C）。從腦組織海馬區(qū)齒狀回切片可以觀察到，與對照組比較，D-半乳糖處理過的小鼠腦顆粒細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞形狀變小，細(xì)胞核形狀改變，發(fā)生固縮，且核深染（見圖3D～F）。

表2 3組小鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

表2 3組小鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

組別SOD/（u/ml）GSH-Px/（u/ml）MDA/（nmol/ml）對照組198.85±9.96301.58±18.285.79±0.57 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組177.81±11.83272.53±16.438.07±1.15 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組166.00±13.93260.00±26.2610.06±1.02 F值7.1435.37927.496 P值0.0080.0200.000

表3 3組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

表3 3組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

組別SOD/（u/mg）GSH-Px/（u/mg）MDA/（nmol/mg）對照組92.84±5.811 015.56±47.450.77±0.03 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組87.23±2.03820.07±41.811.12±0.03 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組78.69±4.29687.13±28.631.83±0.07 F值14.97195.454677.962 P值0.0000.0000.000

表4 3組小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

表4 3組小鼠腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較（n =10，±s）

組別SOD/（u/mg）GSH-Px/（u/mg）MDA/（nmol/mg）對照組196.32±12.1439.83±6.341.70±0.35 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組170.54±17.6130.80±4.782.33±0.54 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組164.71±20.3027.34±6.682.76±0.44 F值4.9686.0537.669 P值0.0250.0140.006

圖2 3組小鼠血清、肝、腦組織生化指標(biāo)比較（n =10，±s）

圖3 小鼠肝臟和腦組織病理切片圖（HE染色）

2.4 肝臟和腦組織HO-1蛋白的表達(dá)

3組大鼠肝臟HO-1蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，500 mg/（kg·d）D-半乳糖組肝HO-1表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半 乳糖組肝HO-1表達(dá)水平高于500 mg/（kg·d）D-半乳糖組（P＜0.05）。3組大鼠腦組織HO-1蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，500 mg/（kg·d）D-半 乳糖組腦HO-1表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05）；1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組腦HO-1表達(dá)水平高于500 mg/（kg·d）D-半乳糖組（P＜0.05）。見表5和圖4。

表5 3組小鼠肝臟和腦組織HO-1蛋白表達(dá)水平比較（n =10，±s）

表5 3組小鼠肝臟和腦組織HO-1蛋白表達(dá)水平比較（n =10，±s）

組別肝臟腦組織對照組1.00±0.001.00±0.00 500 mg/（kg·d）D-半乳糖組1.22±0.031.41±0.09 1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組1.48±0.091.82±0.10 F值161.525104.939 P值0.0000.000

圖4 小鼠肝臟和腦組織HO-1的表達(dá)

3 討論

以往研究對于動物衰老模型的選擇包括以下 5種：①自然衰老小鼠；②快速衰老小鼠SAMP8[4]；③胸腺切除小鼠[5]；④γ射線輻射衰老小鼠模型[6]；⑤D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型。其中D-半乳糖法復(fù)制衰老小鼠模型由我國學(xué)者龔國清等[7]在1991年 提出，因其操作簡便、成本低廉和周期短等優(yōu)點，受到眾多科研工作者青睞。不同文獻(xiàn)報道中使用的D-半乳糖劑量并不一致，最低為50 mg/（kg·d）[8]，而最高可達(dá)1 250 mg/（kg·d）[9]，但多數(shù)研究劑量為120～200 mg/（kg·d）[10-11]，小鼠品種多為ICR和昆明種。目前未見關(guān)于D-半乳糖處理的小鼠是否會發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)改變的報道。C57BL/6J近交系小鼠相比ICR和昆明小鼠具有個體差異小、生長速率慢的特點，用于多種領(lǐng)域的研究[12-13]。關(guān)于D-半乳糖誘導(dǎo)衰老的機制仍不明確，目前有2種猜想：一種認(rèn)為在半乳糖氧化酶的催化下，D-半乳糖反應(yīng)產(chǎn)生醛糖和過氧化氫，導(dǎo)致ROS增加和超氧自由基大量累積，使機體受到損傷，發(fā)生衰老[14]；另一種觀點認(rèn)為，在醛糖還原作用下，體內(nèi)高濃度D-半乳糖被還原為半乳糖醇，不能發(fā)生進(jìn)一步代謝而在細(xì)胞內(nèi)累積，影響到滲透壓，繼而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生腫脹和功能障礙[15]。本研究采用高濃度D-半乳糖 500 mg/（kg·d）和1 000 mg/（kg·d）誘導(dǎo)小鼠衰老模型，研究其對小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響及對小鼠外觀形態(tài)上的改變。

結(jié)本研究果發(fā)現(xiàn)，3組藥物干預(yù)初始體重體重?zé)o顯著性差異，而末次體重D-半乳糖組較對照組低，說明D-半乳糖對小鼠體重有一定影響。此外，本研究中，3組初次和末次體重增值均＞7 g，而其他研究中ICR和昆明小鼠8周內(nèi)體重增值均＜10 g[16-17]，說明C57BL/6J個體差異相對較小，生長速率慢，體重對后續(xù)檢測指標(biāo)影響小，有利于提高檢測結(jié)果的可比性。1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖處理8周后的小鼠頭頸部出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，而其他部位沒有，該癥狀通常與干細(xì)胞、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及黑色素含量喪失密切相關(guān)，與人體衰老特征相似[18-19]，但這種脫毛以1個部位為中心的現(xiàn)象也類似斑禿，這是一種慢性炎癥自身免疫性疾病，以無疤痕脫發(fā)為主要表現(xiàn)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，斑禿與許多因素相關(guān)，其中就包括氧化應(yīng)激[21]。但D-半乳糖是否會誘導(dǎo)出現(xiàn)斑禿并沒有報道，還有待進(jìn)一步研究。

SOD、GSH-Px活性和MDA含量與氧化應(yīng)激和衰老密切相關(guān)[22-23]。其中，SOD與GSH-Px具有很強的清除自由基能力，是機體重要的抗氧化酶，MDA含量能反映脂質(zhì)過氧化的程度及自由基對組織和細(xì)胞的攻擊作用[24]。結(jié)果顯示，D-半乳糖處理過后對以上指標(biāo)都產(chǎn)生影響，盡管500和1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組并不是所有指標(biāo)都有差異，但從趨勢上看1000 mg/（kg·d）D-半乳糖組對以上指標(biāo)影響更大。

衰老在細(xì)胞層面常常表現(xiàn)出細(xì)胞體積縮小，水分減少、核變形固縮、異常分葉、染色加深等病理學(xué)改變[25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠肝小葉細(xì)胞出現(xiàn)水腫、點狀壞死等病理學(xué)改變，這與炎癥密切相關(guān)，提示D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型可能同時伴隨著組織炎癥反應(yīng)，腦海馬區(qū)齒狀回顆粒細(xì)胞核深染固縮，這與細(xì)胞衰老所表現(xiàn)出的現(xiàn)象一致。

HO-1是血紅素加氧酶中的誘導(dǎo)型酶，近年來發(fā)現(xiàn)其廣泛參與體內(nèi)抗炎與抗氧化過程，機體在正常情況下，HO-1的表達(dá)水平很低，但出現(xiàn)氧化應(yīng)激時，作為應(yīng)激蛋白HO-1表達(dá)水平會明顯升高以抑制損傷的發(fā)生[26-27]。目前小鼠衰老模型的主要檢測指標(biāo)仍為生化指標(biāo)，尚無檢測HO-1的報道，本研究顯示，D-半乳糖組小鼠肝臟和腦組織中HO-1表達(dá)水平高于對照組，證實HO-1與小鼠衰老密切相關(guān)。1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖組HO-1表達(dá)水平比500 mg/（kg·d）D-半 乳糖組更高，這與生化檢測結(jié)果趨勢基本一致。

D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老模型是一種簡便的氧化應(yīng)激和抗氧化、抗衰老的研究方法。雖然目前仍存在爭議，但是已廣泛應(yīng)用到氧化應(yīng)激相關(guān)研究中。本研究選用高劑量D-半乳糖誘導(dǎo)個體差異較小的近交系小鼠C57BL/6J，成功地復(fù)制一種可用于氧化應(yīng)激和抗氧化、抗衰老研究的衰老模型。