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        穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖、凋亡 及生物鐘的影響*

        2019-08-22 05:55:52王曜暉趙智權(quán)杜運(yùn)松袁冰舒王剛
        關(guān)鍵詞:生物鐘黃酮基因

        王曜暉,趙智權(quán),杜運(yùn)松,袁冰舒,王剛

        (遵義醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563003)

        穗花杉雙黃酮是卷柏中的一種多酚化合物[1],具有降低血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗輻射及抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[2-15]。肥胖與前脂肪細(xì)胞的過(guò)度分化、增生及脂肪細(xì)胞肥大密切相關(guān)[16]。肥胖機(jī)體出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),相關(guān)炎癥基因表達(dá)升高[17]。晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)輸出周期故障蛋白(circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK)、腦及肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1(the brain and muscle arnt-like protein-1, BMAL1)的異常表達(dá)可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異 常[18-20]。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的穗花杉雙黃酮作用于正常和過(guò)表達(dá)CLOCK的3T3-L1細(xì)胞后,觀察其對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖、凋亡的影響,并探討其與生物鐘基因的關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        穗花杉雙黃酮(160523,純度>98%)購(gòu)自成都瑞芬恩科技有限公司,3T3-L1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,鼠抗CLOCK、兔抗BMAL1、兔抗Cleaved caspase-3及兔抗Bcl-2均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司,抗鼠二抗、抗兔二抗及Click-iTTMEdU Alexa FluorTM555 Imaging Kit均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑和RealMasterMix(SYBR Green)購(gòu)自北京天根生物化學(xué)科技有限公司,正反向引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

        1.2 主要儀器

        CFX96 touch熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)儀(美國(guó)Bio-Rad公司),Gallios流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 藥物配制穗花杉雙黃酮用二甲基亞砜溶解,儲(chǔ)存濃度為10 g/L,0.22μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌,于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们坝门囵B(yǎng)基稀釋至所需濃度。

        1.3.2 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)和分組3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37℃,5%二氧化碳CO2。穗花杉雙黃酮按0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及40.0 mg/L質(zhì)量濃度分成6組。

        1.3.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖將3T3-L1細(xì)胞接種到96孔板中,200μl/孔細(xì)胞懸液,貼壁培養(yǎng)24 h,加入不同質(zhì)量濃度的穗花杉雙黃酮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,以換液的方式加入含10% CCK-8的培養(yǎng)基,培養(yǎng)4 h,測(cè)定450 nm處的吸光度,參比波長(zhǎng)600~650 nm。

        1.3.4 實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, real-time RTPCR)檢測(cè)生物鐘基因的表達(dá)從0 h開始,每間隔4 h(共6次)提取3T3-L1細(xì)胞的總核糖核酸(RNA),并檢測(cè)培養(yǎng)箱中3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1的表達(dá)情況。見表1。

        表1 real-time RT-PCR引物序列

        將不同濃度穗花杉雙黃酮作用于3T3-L1細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后用real-time RTPCR檢測(cè)其表達(dá)情況,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性5 s,57℃退火30 s,57℃延伸5 s,共循環(huán)40次。real-time RT-PCR結(jié)束后,計(jì)算CLOCK和BMAL1 mRNA與β-actin的相對(duì)表達(dá)量。

        1.3.5 Western blotting檢測(cè)生物鐘蛋白的表達(dá)在 6孔板中種入細(xì)胞,24 h后觀察各孔細(xì)胞貼壁均勻,將不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮加入6孔板。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出置于冰上。吸去培養(yǎng)液,加入2 ml/孔預(yù)冷的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS),吸棄。加入200μl/孔預(yù)冷的RIPA裂解液,放置1 min后,用細(xì)胞刮將板底的細(xì)胞刮掉。將細(xì)胞懸浮液吸入1.5 ml離心管,置于冰上。每3 min震蕩15 s,重復(fù)5次。將離心管置于冷凍離心機(jī)中,12 000 r/min離心20 min,取上清凍存至-80℃冰箱,作為后續(xù)Western blotting的樣本。

        將收取的蛋白樣品從-80℃取出,溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白濃度。各組取等量的蛋白樣品混入6×Loading Buffer,加入適量的蛋白裂解液將體積補(bǔ)為20μl,混勻后于4℃?zhèn)溆?。制?%分離膠和5%濃縮膠,放于電泳槽,加入適量電泳液,拔出梳子后,按順序加入蛋白樣品。80 V恒壓30 min后,轉(zhuǎn)為120 V恒壓跑2 h。4℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用TBST溶液溶解5%脫脂奶粉,將膜置于封閉液封閉1 h。按照抗體說(shuō)明書建議濃度稀釋抗體,抗體稀釋液為0.5%脫脂奶粉。一抗室溫孵育4 h后,TBST洗3次,20 min/次。按抗體說(shuō)明書稀釋二抗,室溫孵育1 h,TBST洗3次,每次20 min。在膜上滴加適量的ECL發(fā)光檢測(cè)混合液后,拍照并分析。

        1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況將不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用于3T3-L1細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后用胰酶消化收集細(xì)胞,用冰冷的PBS調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為5×105~1×106個(gè)/ml。取1ml細(xì)胞,4℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清,再次使用冰冷的PBS懸浮細(xì)胞后,以同樣的條件進(jìn)行離心,棄上清液,每管加入100μl Binding buffer懸浮細(xì)胞。依次加入5 μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶,室溫避光條件下,繼續(xù)孵育5 min,加入Binding buffer至500 μl,輕輕混勻,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)0.0、2.5、5.0、10.0、20.0及40.0 mg/L穗花杉雙黃酮對(duì)細(xì)胞凋亡的 影響。

        1.3.7 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖20 mg/L穗花杉雙黃酮可以抑制3T3-L1細(xì)胞的增殖,20 mg/L穗花杉雙黃酮引起CLOCK mRNA和蛋白表達(dá)降低。為證明穗花杉雙黃酮與CLOCK基因的相關(guān)性,將3T3-L1細(xì)胞分為3組:①藥物組:加入20 mg/L穗花杉雙黃酮;②聯(lián)合組:20 mg/L穗花杉雙黃酮處理3T3-L1細(xì)胞24 h后,過(guò)表達(dá)Pc-DNA-CLOCK質(zhì)粒;③對(duì)照組:未做任何處理。檢測(cè)3組細(xì)胞24 h時(shí)的增殖情況。將細(xì)胞消化并接種于96孔板,細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)/孔。培養(yǎng)24 h后,將配好的EdU溶液(20μmol/L)分別加入各孔,100μl/孔,孵育4 h。將96孔板取出,吸棄液體,0.01 mmol/L PBS清洗2遍后,加入4%多聚甲醛固定4 h。室溫0.01 mol/L PBS清洗2次后,用1% TritonX-100處理1 h,加入染色液室溫處理1 h。吸棄染色液后用0.01 mol/L PBS清洗2次,用DAPI進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下觀察染色 情況。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1的周期性表達(dá)

        不同時(shí)間點(diǎn)3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1 RNA的相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各相鄰組間進(jìn)一步兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),0、12及18 h表達(dá)量較為接近,從中選取18 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2和圖1。

        表2 生物鐘基因mRNA相對(duì)表達(dá)量(×10-3,±s)

        表2 生物鐘基因mRNA相對(duì)表達(dá)量(×10-3,±s)

        時(shí)間點(diǎn)CLOCK mRNABMAL1 mRNA 0 h0.605±0.0030.621±0.002 4 h0.675±0.0010.784±0.003 8 h1.011±0.0040.953±0.003 12 h1.423±0.0051.430±0.003 16 h1.193±0.0041.331±0.003 18 h1.114±0.0031.124±0.013 20 h1.025±0.0031.130±0.004 F值92.69893.745 P值0.0000.000

        2.2 穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖的影響

        不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時(shí)的3T3-L1細(xì)胞活性比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=194.485,P=0.000);與0.0 mg/L比較,2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖無(wú)影響(P>0.05),20和40 mg/L穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)。見表3和圖2。

        圖1 不同時(shí)間點(diǎn)3T3-L1細(xì)胞BMAL1和CLOCK mRNA的表達(dá)變化

        表3 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時(shí)的3T3-L1細(xì)胞 活性比較(%,±s)

        表3 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時(shí)的3T3-L1細(xì)胞 活性比較(%,±s)

        注:?與0.0 mg/L比較,P <0.05

        藥物質(zhì)量濃度細(xì)胞相對(duì)活性0.0 mg/L103.17±5.683 2.5 mg/L107.72±2.725 5.0 mg/L108.768±4.040 10.0 mg/L108.664±4.631 20.0 mg/L94.599±1.991?40.0 mg/L69.931±1.0678?F值194.485 P值0.000

        圖2 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞活性的影響(±s)

        2.3 穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡的影響

        各組早期凋亡率、總凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與0.0 mg/L組比較,2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞總凋亡率無(wú)影響(P>0.05),20.0和40.0 mg/L穗花杉雙黃酮促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞凋亡(P<0.05)。見表4。

        2.4 穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

        不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時(shí),3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3和Bcl-2比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與0.0 mg/L 比較,2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮不影響3T3-L1細(xì)胞中Cleaved caspase-3的表達(dá)(P>0.05),20和40 mg/L穗花杉雙黃酮促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞中Cleaved-caspase-3的表達(dá)(P<0.05);與0.0 mg/L比較,2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮不影響3T3-L1細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)(P>0.05),20和40 mg/L穗花杉雙黃酮抑制Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)。見表5和圖3。

        表4 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡的影響(%,±s)

        表4 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡的影響(%,±s)

        注:?與0.0 mg/L比較,P <0.05

        藥物濃度早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率0.0 mg/L3.89±1.651.24±0.975.2±2.55 2.5 mg/L3.64±1.731.52±0.645.5±3.03 5.0 mg/L4.02±0.791.26±1.324.91±0.96 10.0 mg/L4.73±1.252.1±0.685.19±3.57 20.0 mg/L8.37±1.933.32±2.1211.24±4.5?40.0 mg/L19.34±2.363.26±1.2323.44±2.75?F值39.4593.26324.009 P值0.0000.4300.000

        表5 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響(±s)

        表5 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響(±s)

        注:?與0.0 mg/L比較,P <0.05

        藥物質(zhì)量濃度Cleaved caspase-3Bcl-2 0.0 mg/L1.013±0.1691.066±0.171 2.5 mg/L1.025±0.1891.013±0.172 5.0 mg/L1.037±0.1531.084±0.135 10.0 mg/L1.022±0.1551.032±0.133 20.0 mg/L1.533±0.162?0.693±0.129?40.0 mg/L1.723±0.147?0.512±0.125?F值20.39315.057 P值0.0000.000

        圖3 穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響(±s)

        2.5 穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1 mRNA的影響

        不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時(shí),3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與0.0 mg/L比較,2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞18 h時(shí)CLOCK mRNA的轉(zhuǎn)錄無(wú)影響(P>0.05),20和40 mg/L 抑制CLOCK mRNA的轉(zhuǎn)錄(P<0.05);與0.0 mg/L比較,2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞18 h BMAL1 mRNA的轉(zhuǎn)錄無(wú)影響(P>0.05),20和40 mg/L穗花杉雙黃酮抑制3T3-L1細(xì)胞BMAL1 mRNA的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)。見表6和圖4。

        表6 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時(shí)3T3-L1 BMAL1和CLOCK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(×10-3,±s)

        表6 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時(shí)3T3-L1 BMAL1和CLOCK mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(×10-3,±s)

        注:?與0.0 mg/L比較,P <0.05

        藥物濃度CLOCK mRNABMAL1 mRNA 0.0 mg/L0.572±0.0440.723±0.010 2.5 mg/L0.575±0.0230.721±0.011 5.0 mg/L0.594±0.0250.718±0.011 10.0 mg/L0.570±0.0160.720±0.012 20.0 mg/L0.405±0.017?0.591±0.008?40.0 mg/L0.343±0.017?0.513±0.005?F值34.888255.412 P值0.0000.000

        圖4 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對(duì)BMAL1和CLOCK mRNA的影響(±s)

        2.6 穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1蛋白的影響

        不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮作用時(shí),3T3-L1細(xì)胞CLOCK和BMAL1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn),與0.0 mg/L比較,2.5、5.0及10.0 mg/L 穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞的18 h時(shí)CLOCK蛋白的表達(dá)無(wú)影響(P>0.05),20和40 mg/L穗花杉雙黃酮抑制CLOCK蛋白的表達(dá)(P<0.05);與0.0 mg/L比較,2.5、5.0及10.0 mg/L穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1細(xì)胞18 h時(shí)BMAL1蛋白的表達(dá)無(wú)影響(P>0.05),20和40 mg/L穗花杉雙黃酮抑制BMAL1蛋白的表達(dá)(P<0.05)。見表7和圖5。

        表7 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮處理后CLOCK 和BMAL1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

        表7 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮處理后CLOCK 和BMAL1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

        注:?與0.0 mg/L比較,P <0.05

        藥物濃度CLOCK蛋白BMAL1蛋白0.0 mg/L1.053± 0.1670.953±0.035 2.5 mg/L1.173±0.2011.033±0.110 5.0 mg/L1.116±0.1101.043±0.093 10.0 mg/L1.114±0.1291.097±0.172 20.0 mg/L0.551±0.088?0.723±0.040?40.0 mg/L0.447±0.049?0.547±0.050?F值17.38915.219 P值0.0000.000

        圖5 不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮處理后BMAL1和CLOCK蛋白的表達(dá)變化(±s)

        2.7 CLOCK基因?qū)λ牖ㄉ茧p黃酮抑制3T3-L1細(xì)胞增殖的影響

        藥物組、聯(lián)合組、對(duì)照組3T3-L1細(xì)胞增殖情況和CLOCK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗(yàn),聯(lián)合組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率和CLOCK蛋白相對(duì)表達(dá)量高于藥物組(P<0.05),但低于對(duì)照組(P<0.05)。見表8和圖6~8。

        表8 不同處理對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖和CLOCK蛋白表達(dá)的影響(±s)

        表8 不同處理對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖和CLOCK蛋白表達(dá)的影響(±s)

        組別Edu陽(yáng)性細(xì)胞率/%CLOCK對(duì)照組56.333±1.5280.984±0.127藥物組19.333±2.0820.459±0.074聯(lián)合組39.667±2.5170.734±0.065 F值237.71836.151 P值0.0000.000

        圖6 各組3T3-L1細(xì)胞增殖情況

        圖7 3組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率比較(±s)

        圖8 3組3T3-L1細(xì)胞CLOCK蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

        3 討論

        24 h生物節(jié)律被稱作晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律的形成與生物鐘系統(tǒng)的表達(dá)密切相關(guān)[21]?,F(xiàn)已知的生物鐘基因主要有9種,在下丘腦視交叉上核的作用下,調(diào)節(jié)生物體的節(jié)律性活動(dòng)。BMAL1基因處于生物鐘體系的上游,其轉(zhuǎn)錄翻譯后的蛋白產(chǎn)物是正反饋環(huán)路中的調(diào)節(jié)因子,并與CLOCK蛋白結(jié)合形成異二聚體,這些正性成分啟動(dòng)后經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯生成相應(yīng)的蛋白。同時(shí)PER和CRY等負(fù)性成分表達(dá),阻止正性成分的表達(dá)和功能,形成完整的反饋通路。

        在離體3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中,筆者發(fā)現(xiàn)即使脫離機(jī)體中樞SCN生物鐘的影響,脫離周期性的日光照射,離體3T3-L1細(xì)胞在無(wú)光照的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),其生物鐘基因CLOCK和BMAL1仍然呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律的周期性表達(dá),其表達(dá)呈午時(shí)偏高,而凌晨和夜晚偏低的節(jié)律,這與TODA等[22]在離體情況所做的NIH3T3中相關(guān)基因的節(jié)律性表達(dá)相近似,也從側(cè)面證實(shí)生物鐘基因節(jié)律的形成可能與地球自轉(zhuǎn)和公轉(zhuǎn) 有關(guān)。

        肥胖及其并發(fā)癥在全球范圍內(nèi)廣泛存在,其誘因相對(duì)復(fù)雜,主要由代謝異常引起。有資料顯示,肥胖癥的發(fā)生與倒班等晝夜節(jié)律異常有關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn),BMAL1基因在脂質(zhì)代謝、糖平衡和能量代謝中也有十分重要的作用。與此同時(shí),BMAL1與CLOCK組成的異二聚體在調(diào)節(jié)葡萄糖的動(dòng)態(tài)平衡和胰島素抵抗中意義重大。研究表明,BMAL1和/或CLOCK基因異常的小鼠表現(xiàn)出肥胖或體脂減少等癥狀,這些都表明BMAL1、CLOCK基因與肥胖密切相關(guān)。

        穗花杉雙黃酮有降血糖和抗氧化等作用[2],在抑制肥胖的發(fā)生中有十分重要的潛在藥用價(jià)值。穗花杉雙黃酮能否影響3T3-L1細(xì)胞中生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯,從而影響細(xì)胞的增殖和凋亡,尚未有明確的 結(jié)論。

        細(xì)胞是生物體的基本組成部分,3T3-L1作為脂肪前體細(xì)胞在生物體脂肪細(xì)胞的形成及肥胖的發(fā)生過(guò)程中都有著十分重要的作用。穗花杉雙黃酮在較低濃度時(shí)對(duì)3T3-L1細(xì)胞的增殖和凋亡影響不大,高濃度時(shí)抑制其增殖而促進(jìn)其凋亡。Cleaved caspase-3是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的成員,在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起重要作用,而Bcl-2通過(guò)結(jié)合Bax抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示,高濃度穗花杉雙黃酮通過(guò)上調(diào)Cleaved caspase-3表達(dá),下調(diào)Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)凋亡的發(fā)生。這提示穗花杉雙黃酮可能成為潛在的抑制肥胖發(fā)生的藥物,但有待于在整體動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

        通過(guò)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度穗花杉雙黃酮對(duì)生物鐘基因CLOCK、BMAL1 mRNA和蛋白的影響發(fā)現(xiàn),其mRNA和蛋白促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,同時(shí)穗花杉雙黃酮處理后,過(guò)表達(dá)CLOCK基因使被抑制的3T3-L1細(xì)胞增殖率得到一定恢復(fù),這提示穗花杉雙黃酮對(duì)3T3-L1增殖和凋亡的影響與生物鐘基因的表達(dá)有關(guān)。

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