樊 坤，伊艷杰，劉 陽，李 明，王佳奇，王子朝，張慧茹，谷克仁

(1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，鄭州 450001； 2.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，鄭州 450001)

磷脂酶A1可以水解大豆磷脂α位的酰基，產(chǎn)生Sn-1溶血磷脂和脂肪酸，其β位的?；邹D(zhuǎn)移到α位，最終得到穩(wěn)定的Sn-2溶血磷脂，最大限度保留磷脂的營養(yǎng)成分，同時增加磷脂的親水親油平衡值[6]。李招等[7]提出溶血磷脂的乳化性可改變油脂性狀，作為食品添加劑用于食品可增加起酥性，延長貯存期。溶血磷脂通過形成直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物影響水稻淀粉糊化和熱性質(zhì)，促進淀粉酶水解[8]。Kim等[9]發(fā)現(xiàn)溶血磷脂可以提高動物脂肪代謝，改善豬的平均日增重和料肉比。Melero等[10]研究證實了溶血磷脂促進COPII囊泡形成。大豆溶血磷脂還能增加細胞膜的通透性，在一定程度上加快細胞的新陳代謝[11-12]。王恒飛等[13]研究證實低濃度的溶血磷脂通過與海馬神經(jīng)元表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)促進海馬神經(jīng)元凋亡。鄢黎妮等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，低劑量溶血磷脂對小膠質(zhì)細胞有激活增殖作用，而高劑量的溶血磷脂反而有誘導(dǎo)凋亡作用。因此，本試驗對制備的大豆溶血磷脂進行生物安全性檢測，探究溶血磷脂對細胞及動物的安全使用濃度，為溶血磷脂的安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆磷脂：廣州倚德生物科技有限公司濃縮大豆磷脂產(chǎn)品，經(jīng)丙酮萃取、冷凍干燥獲得。磷脂酶A1：丹麥NOVO公司。CCK-8試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所。Caco-2細胞：美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC，HTB037)，細胞在40～60代之間。雞血細胞：取自市售五華雞的靜脈血制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆溶血磷脂的制備和純化

分別稱取60、40、20 g大豆磷脂，置于燒杯中，分別加入200 U/g磷脂酶A1和40、60、80 mL蒸餾水混勻，將燒杯置于60℃水浴9 h，期間不斷攪拌，反應(yīng)結(jié)束后置于90℃水浴中30 min滅酶活。然后于-40℃真空冷凍干燥72 h，獲得粗大豆溶血磷脂。

將3種不同體系獲得的大豆溶血磷脂A(60%大豆磷脂-水)、B(40%大豆磷脂-水)和C(20%大豆磷脂-水)分別置于燒杯中，加入300 mL三氯甲烷-甲醇(體積比2∶1)混合溶液溶解，3 500 r/min離心10 min，去除不溶物，所得溶液55℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至高濃度，再用丙酮萃取，所得沉淀-40℃真空冷凍干燥24 h后，-20℃保存，得到純化大豆溶血磷脂。

1.2.2 水解率測定

分別稱取4 g 1.2.1水浴處理后的產(chǎn)物大豆溶血磷脂和對照按1.2.1不加酶水浴處理后的大豆磷脂，加入pH為5.0的0.5%聚乙烯醇10 mL，磁力攪拌10 min溶解，用KOH標準液進行滴定，記錄消耗的KOH標準液的體積。計算酶解產(chǎn)物和大豆磷脂的酸價，計算水解率。

X=(C-D)M/(56.1×1 000)×100%

式中：X為酶解反應(yīng)的水解率，%；C為酶解產(chǎn)物酸價(KOH)，mg/g；D為對照大豆磷脂酸價(KOH)，mg/g；M為大豆磷脂的平均相對分子質(zhì)量；56.1是KOH的相對分子質(zhì)量。

1.2.3 紅外光譜檢測

在兩個碾磨器中分別加1 mg大豆溶血磷脂和大豆磷脂，再加200 mg KBr，室溫下碾磨均勻壓片，采用傅里葉紅外光譜儀分析官能團的變化。

1.2.4 溶血性檢測

將雞血加入抗凝管，上下輕輕混勻，加生理鹽水，2 500 r/min離心10 min，棄去上清及白細胞層，再用生理鹽水沖洗紅細胞，重復(fù)離心洗滌3～5次，棄去上清，用移液槍準確吸取100 μL底部沉積的雞紅細胞于生理鹽水中，倒置混勻，配成5 mL體積分數(shù)2%的紅細胞溶液。

吸取100 μL紅細胞溶液于蒸餾水中，室溫下振蕩30 min，使其全部溶血，配成10 mL體積分數(shù)1%全溶血對照溶液。

稱取大豆溶血磷脂、大豆磷脂各180 mg，分別加入丙三醇1 mL，60℃水浴120 min，每15 min攪拌一次，加生理鹽水配成大豆溶血磷脂和大豆磷脂1 mg/mL(丙三醇體積分數(shù)0.56%)溶液，再依次稀釋成大豆溶血磷脂和大豆磷脂質(zhì)量濃度分別為500、200、100、50 μg/mL的溶液。

分別吸取各濃度梯度的溶液100 μL置于96孔酶標板中，體積分數(shù)0.56%的丙三醇-生理鹽水溶液100 μL作為空白對照，每孔加入2%的紅細胞溶液100 μL，以200 μL全溶血溶液作為全溶血對照，每個梯度3個重復(fù)，輕輕振蕩酶標板，室溫下靜置3 h。對應(yīng)吸取上清溶液100 μL至新的酶標板中，575 nm下測溶液吸光度，按下式計算溶血率。

溶血率=(測試溶液吸光度-空白對照吸光度)/全溶血對照吸光度×100%

1.2.5 細胞毒性的檢測

取10 mL胎牛血清、3 mL青鏈霉素混合液、1 mL 非必需氨基酸溶于85.4 mL DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基，0.22 μm濾膜過濾除菌，配制為基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)液。在基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)液中加入滅菌丙三醇配制成體積分數(shù)0.56%的丙三醇細胞培養(yǎng)液。

取紫外消毒的大豆溶血磷脂和大豆磷脂各180 mg，用1 mL無菌丙三醇溶解，加入1 mL無菌0.56%丙三醇細胞培養(yǎng)液混合均勻，吸取100 μL混合液至基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)液中配成9 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL的大豆溶血磷脂和大豆磷脂溶液。然后分別吸取200、150、100、50、20 μL至1 mL離心管中，添加0.56%丙三醇細胞培養(yǎng)液至200 μL，再添加基礎(chǔ)培養(yǎng)液至1 mL，配成溶血磷脂和大豆磷脂質(zhì)量濃度分別為200、150、100、50、20 μg/mL的細胞培養(yǎng)液(丙三醇體積分數(shù)為0.11%)。

把生長密度在70%～80%的Caco-2細胞消化離心，細胞計數(shù)法計數(shù)，在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種1.0×104個Caco-2細胞。培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗細胞2次，分別加入大豆溶血磷脂和大豆磷脂質(zhì)量濃度為200、150、100、50、20 μg/mL的細胞培養(yǎng)液200 μL。每個梯度設(shè)3個重復(fù)，用0.11%丙三醇基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)液作為對照。培養(yǎng)48 h后，吸出原培養(yǎng)液，添加基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)液，同時加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)1 h后，450 nm下測吸光度，按下式計算細胞成活率。

細胞存活率=試驗組吸光度/對照組吸光度×100%

1.2.6 統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后，用SPSS軟件Anova進行顯著性檢驗，并采用Duncan法進行多重比較，分析各組之間的差異性。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆溶血磷脂的性狀

采用磷脂酶A1在60%大豆磷脂-水相體系中制得A溶血磷脂樣品、40%大豆磷脂-水相體系中制得B溶血磷脂樣品、20%大豆磷脂-水相體系中制得C溶血磷脂樣品，經(jīng)過丙酮萃取，真空冷凍干燥后，所獲得的大豆溶血磷脂顏色呈棕色，凝結(jié)成塊狀，無明顯豆腥味。3種不同體系制備的大豆溶血磷脂肉眼觀察無明顯差別。

大豆磷脂是黃色、具有明顯豆腥味的粉末狀物質(zhì)，經(jīng)磷脂酶A1改性，大豆溶血磷脂在色澤、狀態(tài)和氣味上都與大豆磷脂有明顯區(qū)別，與Hirai等[15]在水相體系中制備的大豆溶血磷脂在狀態(tài)和色澤上類似。

2.2 大豆溶血磷脂水解率(見表1)

表1 大豆溶血磷脂的水解率 %

由表1可知，在3種酶解體系中，40%大豆磷脂- 水體系制得B樣品的水解率最高，酶解效果最好。因此，以40%大豆磷脂-水體系制備大豆溶血磷脂。40%大豆磷脂-水體系的水解率為101.6%，推測可能是在酶解過程中，產(chǎn)生的Sn-1溶血磷脂不穩(wěn)定，極少數(shù)Sn-2位的脂肪酸發(fā)生了?；莆?，也產(chǎn)生少量脂肪酸，使得水解率大于100%。陳斌斌[16]在水相體系中對大豆磷脂改性的水解率為111.8%，也明顯高于100%。

2.3 大豆溶血磷脂的紅外光譜

大豆溶血磷脂紅外光譜分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 大豆溶血磷脂的紅外光譜圖

2.4 大豆溶血磷脂的溶血性

按1.2.4檢測大豆溶血磷脂和大豆磷脂的溶血率，結(jié)果見表2。

表2 大豆溶血磷脂的溶血率

注：同列數(shù)據(jù)不同肩標大寫字母表示P<0.01，小寫字母表示P<0.05。下同。

由表2可以看出，大豆溶血磷脂和大豆磷脂溶液都有溶血現(xiàn)象。隨著大豆磷脂質(zhì)量濃度的降低，溶血率急劇下降，1 000 μg/mL大豆磷脂的溶血率為12.3%，而在50 μg/mL時溶血率為0.2%；大豆溶血磷脂也表現(xiàn)出相同的趨勢，大豆溶血磷脂在1 000 μg/mL時，溶血率為40.9%，而在50 μg/mL時溶血率為1.1%。

雖然大豆溶血磷脂和大豆磷脂都有溶血現(xiàn)象出現(xiàn)，相比較而言，大豆溶血磷脂在相同質(zhì)量濃度下的溶血現(xiàn)象均明顯高于大豆磷脂，證實大豆磷脂改性后形成的溶血磷脂增加了溶血性。從溶血率來看，除了大豆磷脂1 000、500 μg/mL的溶血率為12.3%和5.7%,大豆溶血磷脂1 000、500 μg/mL的溶血率為40.9%和9.3%以外，其余各組溶血率均低于5%。根據(jù)國標規(guī)定，低于5%的溶血率視為生物安全[17]，建議采用低于200 μg/mL磷脂進行細胞和動物試驗，是屬于生物安全的。蔡偉惠等[18]采用兔血制備體積分數(shù)2%的紅細胞液檢測丙泊酚納米注射液中溶血磷脂的溶血率，3批樣品溶血磷脂含量分別為0.313、0.273、0.318 mg/mL，而溶血率分別為2.70%、3.37%、3.04%，證實丙泊酚納米注射液中溶血磷脂的溶血率均小于5%，產(chǎn)品符合國標要求。

2.5 大豆溶血磷脂的細胞毒性(見表3)

表3 大豆溶血磷脂的細胞存活率

用CCK-8試劑盒檢測大豆溶血磷脂對Caco-2細胞的毒性。Caco-2細胞是腸道細胞系，口服溶血磷脂首先接觸腸道細胞，故以Caco-2腸道細胞來檢驗其細胞毒性。由表3可知，隨著大豆磷脂質(zhì)量濃度的降低，Caco-2細胞存活率逐漸升高。在含200 μg/mL大豆磷脂的培養(yǎng)液中，細胞存活率只有46.4%，當大豆磷脂的質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，細胞存活率達87.4%。隨著大豆磷脂質(zhì)量濃度的降低細胞存活率升高，說明大豆磷脂對細胞有一定的損傷。

大豆溶血磷脂也表現(xiàn)出相同的趨勢。在200 μg/mL時，Caco-2細胞存活率為42.1%，而20 μg/mL時，Caco-2細胞存活率為80.5%。相比較同質(zhì)量濃度的大豆磷脂而言，大豆溶血磷脂的細胞存活率略低，說明大豆溶血磷脂對細胞的損傷略高。

3 結(jié) 論

試驗通過磷脂酶A1在60℃、40%大豆磷脂-水體系改性大豆磷脂得到一種水溶性好、抗氧化性強的大豆溶血磷脂，并且對大豆溶血磷脂的生物安全性進行探究。試驗結(jié)果顯示：大豆溶血磷脂和大豆磷脂均有溶血現(xiàn)象，且二者在200 μg/mL質(zhì)量濃度以下溶血率均低于5%，可視為生物安全；大豆磷脂低于50 μg/mL以下和大豆溶血磷脂低于20 μg/mL以下使用，Caco-2細胞的存活率均大于80%，但相關(guān)的機制還有待深入研究。