孫曉花, 尹利明, 趙燕娜, 宋明芬, 宋海東△
(1杭州市第七人民醫(yī)院, 浙江 杭州 310013; 2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 浙江 杭州 310006)
小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞,廣泛分布在腦和脊髓,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)報道,當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭受損傷,如炎癥和外傷時,小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)進(jìn)入炎癥激活狀態(tài),分泌大量炎癥介質(zhì)[1][如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)等],活化吲哚胺2,3-雙加氧酶(indolamine 2, 3-dioxygenase,IDO)[2],影響神經(jīng)遞質(zhì)代謝[3],參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程[4]。有研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA,miRNA,miR)-155是炎癥的重要調(diào)控分子[5],但其如何調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子分泌以及IDO的表達(dá)尚不清楚。因此,本文重點探索miR-155對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子分泌和IDO表達(dá)的影響。
小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)購自Sigma;慢病毒載體由上海吉凱生物科技有限公司提供;流式液相芯片試劑盒購自BD;抗IDO、細(xì)胞因子信號抑制物1(suppressor of cytokinke signalling 1, SOCS1)和p-p38 MAPK抗體購自CST。
2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BV-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,細(xì)胞貼壁生長密度達(dá)80%左右傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。
2.2構(gòu)建mmu-miR-155慢病毒載體 參考miRBase 數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org)小鼠miR-155基因成熟序列(MIMAT0000165):5’-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3’,設(shè)計分別帶有AgeI/NheI酶切位點的miR-155序列(5’-GAGGATCCCC-GGGTACCGGTTTCTCTTTGCAGGTGCTGC-3’,3’-CA-CACATTCCACAGGCTAGGTCTGACATCTACGTTCAT-C-5’)和陰性對照序列,由上海生工生物有限公司合成;將miR-155 單鏈退火并通過T4DNA ligase連接到GV365慢病毒載體(由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供),4 ℃過夜;轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,均勻涂布于含puromycin的LB平板上并挑取菌落。PCR鑒定陽性菌落(PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,22個循環(huán);72 ℃ 5 min),培養(yǎng)陽性克隆并測序驗證。20 μg GV365載體、15 μg pHelper 1.0載體質(zhì)粒和10 μg pHelper 2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)72 h。高速離心并收集細(xì)胞上清,采用熒光、藥物篩選和絕對定量法測定病毒滴度。
2.3mmu-miR-155慢病毒載體感染BV-2細(xì)胞及分組 mmu-miR-155慢病毒載體感染BV-2細(xì)胞,根據(jù)病毒滴度、病毒體積、感染培養(yǎng)基以及感染效率,確定感染復(fù)數(shù)(MOI)為10的感染條件,進(jìn)行后續(xù)實驗。實驗分為空白對照(control, Con)組、LPS組、慢病毒陰性對照(negative control,NC)組和mmu-miR-155感染組(miR-155-UP組)。LPS組:200 μg/L LPS刺激BV-2細(xì)胞30 min~12 h;NC組:攜帶對照序列的慢病毒載體感染BV-2細(xì)胞8 h后換液,常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至72 h;miR-155-UP組: 攜帶mmu-miR-155慢病毒載體感染BV-2細(xì)胞8 h后換液,常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至72 h;空白對照組:BV-2細(xì)胞未作額外處理。
2.4流式液相芯片測定BV-2細(xì)胞分泌炎癥因子的含量 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,按照說明書操作,制備捕獲6種細(xì)胞因子IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)、TNF-α、IL-10、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)和IL-12 p70的微球混合液,分別與標(biāo)準(zhǔn)品、樣品結(jié)合反應(yīng),室溫孵育2 h。洗滌1次,重懸后上機(jī)分析。所獲數(shù)據(jù)用BD CBA分析軟件自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將樣品數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合,并計算培養(yǎng)上清中6種細(xì)胞因子含量。
2.5Real-time PCR實驗 采用TRIzol法提取細(xì)胞的RNA,Promega M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。Real-time PCR檢測IL-6、TNF-α、IL-10和IDO的mRNA和mmu-miR-155-5p的表達(dá)水平,詳細(xì)引物序物見表1。此外,內(nèi)參照U6的引物和mmu-miR-155-5p引物購自廣州市銳博生物科技有限公司,產(chǎn)品編號為MQPS0002476-1-100。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達(dá)量。
表1 Real-time PCR引物序列
F: forward; R: reverse.
2.6Western blot法檢測SOCS1和IDO的蛋白水平 收集貼壁細(xì)胞,采用細(xì)胞裂解液(含50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑)提取總蛋白。將40 μg蛋白加入20 μLSDS凝膠加樣緩沖液中,煮沸后,經(jīng)SDS-PAGE分離后,將蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到NC膜(Amersham)上,分別加抗SOCS1、IDO和磷酸化p38MAPK 抗體,室溫結(jié)合反應(yīng)1 h,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(Santa Cruz)室溫孵育,經(jīng)充分洗滌后用ECL發(fā)光劑(Amersham)作用1 min,采用灰度掃描系統(tǒng)測定并分析目的蛋白條帶。同樣實驗重復(fù)3次。
采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,各指標(biāo)差異檢驗采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
Con組細(xì)胞體積較小,有分支狀突起;LPS組細(xì)胞體積增大,分支狀突起減少,變短,增粗,提示小膠質(zhì)細(xì)胞處于激活狀態(tài); miR-155-UP組細(xì)胞突起較NC組略減少,變短,增粗,見圖1。
Figure 1. The morphological changes of the BV-2 cells (×200).
圖1 BV-2 細(xì)胞形態(tài)的變化
LPS組mmu-miR-155的表達(dá)水平高于Con組(P<0.01);miR-155-UP組的mmu-miR-155表達(dá)水平高于NC組(P<0.01),見圖2。
LPS組炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-12 p70的分泌水平均高于Con組(P<0.05)。miR-155-UP組炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-10分泌水平均高于NC組(P<0.05),但I(xiàn)L-12 p70分泌水平低于NC組(P<0.05),見圖3。這提示miR-155 具有類LPS的作用,能夠促進(jìn)BV-2細(xì)胞分泌多種炎癥因子。
Figure 2. The expression of miR-155 in the BV-2 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsNC group.
圖2 miR-155在BV-2細(xì)胞的表達(dá)水平
LPS組IL-6、TNF-α、IL-10和IDO的mRNA表達(dá)水平顯著高于Con組(P<0.01)。miR-155-UP組IL-6、TNF-α、IL-10和IDO的mRNA表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.01),見圖4,提示miR-155 具有類LPS的作用,能夠促進(jìn)BV-2細(xì)胞多種炎癥因子的mRNA表達(dá)。
200 μg/L LPS刺激BV-2細(xì)胞的時效關(guān)系顯示,刺激30 min時p-p38 MAPK的蛋白水平明顯增高,并且隨著刺激時間延長,p-p38 MAPK的蛋白水平較30 min時增加(P<0.01),見圖5。
200 μg/L LPS刺激BV-2細(xì)胞2 h,IDO、SOCS1和p-p38MAPK的蛋白水平均高于Con組(P<0.01);miR-155-UP組的IDO和p-p38MAPK蛋白水平均高于NC組(P<0.01),而SOCS1的蛋白表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.01),見圖6。
活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌多種炎癥因子,早期表現(xiàn)為胞體增大,細(xì)胞表面的突起緊縮,變短,增粗,從而由分枝狀的靜息小膠質(zhì)細(xì)胞變?yōu)闊o突起的活化的阿米巴樣巨噬細(xì)胞[6],參與多種中樞炎癥性疾病的發(fā)病。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,體內(nèi)能夠誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng),體外能夠刺激炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子,常用于研究炎癥相關(guān)機(jī)制[7]。因此,本文采用LPS刺激BV-2細(xì)胞,作為陽性對照。
Figure 3. The secretion of inflammatory factors in the BV-2 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon group;#P<0.05,##P<0.01vsNC group.
圖3 炎癥因子在BV-2細(xì)胞中分泌水平比較
Figure 4. The mRNA expression of inflammatory factors and IDO in the BV-2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsNC group.
圖4 炎癥因子及IDO的mRNA 在BV-2細(xì)胞表達(dá)
Figure 5. The time-dependent manner of p-p38 MAPK expression in the BV-2 cells stimulated with LPS. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 min group.
圖5 LPS刺激BV-2細(xì)胞p38 MAPK磷酸化水平的時效關(guān)系
Figure 6. The protein levels of IDO, SOCS1 and p-p38 MAPK in the BV-2 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsNC group.
圖6 BV-2細(xì)胞中IDO、SOCS1和p-p38MAPK蛋白水平的變化
受到LPS刺激的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌多種炎癥因子,如IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-12等,表明BV-2細(xì)胞處于炎性活化狀態(tài),同時我們發(fā)現(xiàn)miR-155和IDO的表達(dá)水平也有所升高。研究報道,IDO是一種色氨酸降解酶,調(diào)控色氨酸代謝[8],并且研究發(fā)現(xiàn)IDO的表達(dá)水平與抑郁發(fā)病高度相關(guān)[9],提示活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可能參與炎癥性中樞神經(jīng)與精神疾病的發(fā)生。
我們的預(yù)實驗結(jié)果顯示BV-2細(xì)胞在靜息狀態(tài)時miR-155的表達(dá)水平較低。而采用攜帶miR-155序列的慢病毒載體感染BV-2細(xì)胞后,我們發(fā)現(xiàn)miR-155可促進(jìn)IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-10 等多種炎癥因子分泌,抑制IL-12分泌,與Zheng等[10]和Cui等[11]的報道一致。提示miR-155也能夠活化小膠質(zhì)細(xì)胞。
文獻(xiàn)報道SOCS1是miR-155的靶基因之一;miR-155能夠結(jié)合并降解SOCS1的mRNA,導(dǎo)致SOCS1的蛋白水平下降,解除SOCS1蛋白對炎癥的負(fù)調(diào)控作用,促進(jìn)炎癥因子分泌[12]。本文研究結(jié)果顯示miR-155能夠下調(diào)SOCS1蛋白的表達(dá),上調(diào)磷酸化p38MAPK和IDO的蛋白水平。因此,miR-155促進(jìn)BV-2細(xì)胞分泌炎癥因子,其機(jī)制可能與下調(diào)SOCS1蛋白,間接上調(diào)p-p38 MAPK的水平有關(guān)。
miR-15能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌多種炎癥因子,下調(diào)SOCS1蛋白的表達(dá),上調(diào)p-p38MAPK和IDO的蛋白水平,提示miR-155可能參與中樞神經(jīng)及精神疾病的炎癥發(fā)生發(fā)展。