任召珍 陳志兵 劉志敏

摘要：建立鯽魚中硝基呋喃代謝物殘留量測定的液相色譜-串聯(lián)質譜分析方法，并分析AOZ在鯽魚中殘留消除規(guī)律。樣品采用鹽酸、2-硝基苯甲醛衍生提取，乙酸乙酯萃取后，進行液相色譜-串聯(lián)質譜測定，同位素內標定量。結果顯示，該方法在0～20.0 μg/L范圍內線性關系良好，4種硝基呋喃類代謝物回收率在91.7%～98.5%之間，相對標準偏差為1.87%～6.93%，方法檢出限為SEM 0.40，AOZ 0.25，AMOZ 0.20，AHD 0.45。鯽魚內AOZ殘留消除試驗發(fā)現(xiàn)，AOZ停藥后最高蓄積殘留量為218.25 μg/kg。鯽魚肉內AOZ代謝消除緩慢，120 d后代謝殘留物低于0.5 μg/kg。

關鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質譜;硝基呋喃代謝物;鯽魚;代謝規(guī)律

中圖分類號：TS207 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）12-0238-04

硝基呋喃類藥物是一種抗生素，其代謝物主要有5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-內酰脲（AHD）、3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）4種，對大多數革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和原蟲等病原體均有殺滅作用，主要用于防治敏感菌所致的細菌性痢疾、腸炎、霍亂。由于其廣譜的殺菌能力曾被廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)，但研究發(fā)現(xiàn)該類藥物具有相當大的毒性，可致胎兒畸形、誘發(fā)癌癥等[1-2]。歐盟關于修訂有關指定用于確定最大殘留限量的共同體程序的第2377/90/EEC（1995）號指令中把硝基呋喃列入A類禁用藥[3]，并于2003年規(guī)定最低殘留限量（MRL）為1 μg/kg[4]。我國動物性食品中獸藥最高殘留限量——農業(yè)部235公告也明確規(guī)定，此類藥物不得在動物性食品中檢出[5]。即便如此，硝基呋喃類代謝物在動物源食品中仍時有檢出。據山東省食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的食品安全通報發(fā)現(xiàn)，黃花魚、松花魚、雞肉等多起動物源食品中呋喃唑酮代謝物超標[6]。目前，硝基呋喃代謝物的分析方法有酶聯(lián)免疫法[7]、高效液相色譜法[8-9]和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[10-13]。其中，液相色譜-串聯(lián)質譜法因其靈敏度高、準確性和重復性好等特點得到廣泛應用。本試驗在此基礎上以鯽魚為研究對象，采用更為便捷的檢測方法對鯽魚中硝基呋喃類代謝物進行測定，并對呋喃唑酮的代謝規(guī)律進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 甲醇、乙酸乙酯、正己烷、甲酸、2-硝基苯甲醛、醋酸銨皆為色譜純;鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀皆為分析純;標準品購自德國Dr. Ehrenstorfer標準品公司，純度≥99.0%;水為超純水。

1.1.2 硝基呋喃代謝物標準儲備溶液 采用甲醇溶液分別將AOZ、AMOZ、AHD、SEM溶解配制成100 mg/L的標準溶液，置于-18 ℃冰箱避光保存。

1.1.3 混合標準中間溶液 分別準確吸取適量標準儲備溶液，將以上4種硝基呋喃代謝物配制成濃度為10 mg/L的混合標準中間溶液，置于-18 ℃冰箱避光保存。

1.2 儀器和設備

高效液相色譜串聯(lián)質譜儀（LC-MS/MS）：Thermo TSQ Quantum Access Max，電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司];旋轉蒸發(fā)器（東京理化器械株式會社）;離心機（株式會社日立制作所）;均質器（IKAT18）;旋渦混合器（德國IKA公司）;pH計（梅特勒—托利多集團）;恒溫水浴振動器（常州國華電器有限公司，SHA-B）;氮吹儀（鄭州安晟科學儀器有限公司）。

1.3 水解和衍生

準確稱取制備均勻的鯽魚樣品2.00 g（精確至0.01 g）于 50 mL 離心管中，加入10 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液，加入適量內標標準溶液（100 μL 100 mmol/L 2-硝基苯甲醛溶液），旋渦均勻，放入37 ℃水浴避光振蕩16 h。

1.4 提取凈化

將水解衍生完成的樣品取置室溫，于離心管中加入 1.5 mL 1 mol/L磷酸氫二鉀溶液，并用3 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至7.0～7.5間。10 000 r/min離心5 min，上清溶液轉移至另一離心管中并加入10 mL乙酸乙酯，高速渦旋振蕩 1 min，再次10 000 r/min離心5 min，取乙酸乙酯層于 15 mL 離心管中，40 ℃氮氣吹干。準確加入1.0 mL甲醇-水溶液（體積比為8 ∶ 2），2 mL正己烷，渦旋振蕩30 s，取下層溶液于 1.5 mL EP管中，15 000 r/min離心10 min，定容液經 0.22 μm 微孔濾膜過濾，于進樣瓶中待測。

標準品采用與樣品相同方法處理后待測。

1.5 色譜-質譜條件

1.5.1 液相條件 色譜柱：C18，10 cm×5 μm×0.21 mm（Thermo）;柱溫：30 ℃;流速：250 μL/min;進樣量：10 μL;流動相：甲醇/5 mmol/L乙酸銨溶液（0.1%甲酸）。

1.5.2 質譜條件 離子源溫度（配備ESI源）：350 ℃;噴霧電壓：4 500 V;鞘氣：40arb;輔助氣：10arb;硝基呋喃代謝物的離子參數見表1。

1.6 AOZ在鯽魚中的代謝試驗

配制含AOZ 2 mg/kg濃度飼料，鯽魚苗體長約4 cm，養(yǎng)殖水溫為（20±2） ℃，養(yǎng)殖密度為30尾/m3，投喂量為3%，每天投喂2次（上午、下午各1次），投喂時間為5 d。養(yǎng)殖密9度和飼料粒徑隨鯽魚增長進行調整。投喂結束后2、4、6、12 h，1、2、4、8、16、20、30、40、60、90、120 d取樣測定鯽魚肉中AOZ殘留量。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優(yōu)化

取2.0 mg/L標準品，由蠕動泵進入質譜，離子源切換到正離子模式，調試離子源的噴霧電壓，觀察硝基呋喃化合物Full Scan模式下母離子的響應情況，確定噴霧電壓、鞘氣和輔助氣流量;在MRM模式下自動掃描，確定響應最高、最穩(wěn)定的碰撞能量，由此確定該方法的質譜條件，參數見表1。2 μg/L 濃度混合標準品參考圖譜（圖1）。在優(yōu)化的質譜條件下，4種硝基呋喃代謝物8 μg/L濃度混合標準品分離度合理，峰形對稱且峰形良好，并且在儀器上表現(xiàn)出良好的響應，靈敏度高，在此條件下可以進行4種硝基呋喃代謝物的分離測定。

2.2 液相條件的優(yōu)化

根據硝基呋喃類藥物性質及質譜條件，采用乙腈或甲醇作為有機相，0.1%甲酸和5 mmoL/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）作為水相。根據調試，甲醇可更好地提高檢測靈敏度和分離效果，水相中加入乙酸銨可提高離子化效率，以獲得理想色譜峰，因此確定使用甲醇-5 mmoL/L乙酸銨溶液（含 0.1% 甲酸）做流動相，具體的流動相比例詳見表2。

2.3 線性方程和檢出限

配制濃度為0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的混合標準曲線，以內標法定量繪制標準曲線，硝基呋喃化合物在0～20.0 μg/L濃度范圍內響應呈線性關系（r2>0.99），以信噪比（S/N）=3及標準品濃度計算硝基呋喃類代謝物檢出限，詳見表3。

2.4 衍生條件的優(yōu)化

2.4.1 2-硝基苯甲醛溶劑的選擇 由于硝基呋喃類代謝物分子量小，HPLC-MS/MS直接測定響應不好，靈敏度低，因此一般對其衍生化后再進行測定，常用衍生化試劑是2-硝基苯甲醛[14]。2-硝基苯甲醛常用二甲亞砜[10-11]和甲醇[12]溶解。試驗過程中衍生濃度2 μg/L混合標準品，分別使用甲醇和二甲亞砜溶解，2-硝基苯甲醛作為衍生化試劑，詳見表4。由結果可知，甲醇和二甲亞砜溶解的衍生化試劑對結果并無太大影響，考慮二甲亞砜易滲入皮膚，低溫易凝固的特點，本試驗采用甲醇溶解2-硝基苯甲醛。

2.4.2 衍生方式的選擇 根據目前硝基呋喃代謝物檢測標準，衍生方式有避光衍生[10-11]和直接衍生[12]，本試驗對 2 μg/L 標準品分別進行避光衍生和直接衍生，結果見表5。由于硝基呋喃類藥物代謝快速且對光敏感[15]，所以進行避光衍生。

2.5 提取條件的優(yōu)化

2.5.1 離心速率影響 通常硝基呋喃類藥物在提取時采用4 000 r/min離心[10-11]，但對于蛋白和脂肪含量高的樣品，在此速率下即使離心10 min，離心管上層仍漂浮有雜質，另外用乙酸乙酯提取時，也易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，若分離不完全，對于檢測結果會造成一定影響。提高離心速率對這類現(xiàn)象有明顯改善，離心速率越高效果越好，因此本試驗在分離和提取過程中皆采用10 000 r/min離心分離。氮吹后，采用正己烷除脂后易出現(xiàn)定容液與正己烷乳化現(xiàn)象，在15 000 r/min下離心 10 min，可使正己烷漂浮于上層，可徹底除去提取的脂肪，降低樣品基質干擾。

2.5.2 乙酸乙酯提取次數的影響 農業(yè)部781號公告-4-2006[10]和GB/T 21311—2007《動物源性食品中硝基呋喃類代謝殘留量監(jiān)測方法》[12]標準方法中乙酸乙酯皆提取2次。因硝基呋喃類藥物采用內標法進行定量，通過質控樣品分析發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取1次，硝基呋喃類藥物的回收率和相對標準偏差均在范圍內，詳見表6。因此采用1次提取法，不僅可簡化提取步驟，還可減少試劑使用。

2.6 回收率試驗

取陰性鯽魚肉樣，分別加入硝基呋喃類標準品，使添加濃度分別為0.5、1.0、5.0 μg/L，每個濃度6個平行樣品，測其回收率及相對標準偏差。由表6可知，本方法4種硝基呋喃類代謝物的回收率均為91.7%～98.5%，相對標準偏差（RSD）為1.87%～6.93%，回收率和相對標準偏差均符合標準要求。

2.7 AOZ在鯽魚內的代謝規(guī)律

由圖2可知，AOZ在鯽魚中投喂結束后0～6 h，AOZ含量呈上升趨勢，在 6 h時測得最高含量為218.25 μg/kg，在 6～96 h 間AOZ殘留量下降趨勢明顯，之后呈緩慢下降趨勢，直至120 d后在鯽魚中無AOZ檢出。這與譚志軍等研究呋喃唑酮對大菱鲆內的代謝規(guī)律[16]和劉書貴等研究呋喃唑酮在雜交鱧（斑鱧♀×烏鱧♂）體內殘留消除規(guī)律[17]有相似之處。據食品藥品監(jiān)督管理局的食品安全抽查結果顯示，當前水產品中呋喃唑酮仍時有檢出，說明仍存在違禁使用現(xiàn)象。本試驗結果顯示，AOZ在鯽魚體內代謝消除仍然非常緩慢，如果違禁使用還是存在很大風險。

3 結論

本研究建立了以鹽酸溶液衍生提取，乙酸乙酯萃取，經液相色譜-串聯(lián)質譜測定，并以對應同位素內標定量的硝基呋喃類代謝物殘留測定方法。方法準確度高、精密度好、符合殘留檢測要求。通過對飼喂鯽魚中AOZ殘留消除規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，AOZ在本試驗條件下，120 d后鯽魚中AOZ殘留完全消除。如果試劑使用劑量大或時間長，消除時間還可能更長，因此違禁使用AOZ存在很大風險，這為硝基呋喃類藥物的監(jiān)管提供了一定試驗依據。

參考文獻：

[1]Bartel L C. Montalto de M M，Castro J A.Nitroreductive metabolic activation of some carcinogenic nitro heterocyclic food contaminants in rat mammary tissue cellular fractions[J]. Food and Chemical Toxicology，2008，47（1）：140-144.

[2]Vass M，Hruska K，F(xiàn)ranek M. Nitrofuran antibiotics：a review on the application，prohibition and residual analysis[J]. Veterinarni Medicina，2008，53（9）：469-500.

[3]（EEC）No 2377/90. Laying down a community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin[S]. 1990.

[4]（EC） No 181/2003.Amending decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits （MRRLs） for certain residues in food of animal origin[S]. 2003.

[5]中華人民共和國農業(yè)部公告第235號[Z].北京：中華人民共和國農業(yè)部，2002.

[6]SFDA：山東省食品安全監(jiān)督抽檢信息通告018年第5期（總第134期），2017年第26期（總第105期），2007年第19期（總第98期）[Z].

[7]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. 出口動物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定 酶聯(lián)免疫吸附法：SN/T 3380—2012[S]. 北京：國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2013.

[8]農業(yè)部. 水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜法：農業(yè)部1077號公告-2—2008[S]. 北京：農業(yè)部，2008.

[9]王 媛，蔡友瓊，賈東芬，等. 高效液相色譜法檢測水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量[J]. 分析試驗室，2009，28（12）：86-90.

[10]農業(yè)部. 動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法：農業(yè)部781號公告-4—2006[S]. 北京：農業(yè)部， 2006.

[11]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標準化管理委員會. 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法：GB/T 20752—2006[S]. 北京：國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標準化管理委員會， 2006.

[12]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標準化管理委員會. 動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質譜法：GB/T 21311—2007[S]. 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標準化管理委員會， 2007.

[13]王 狄，張嘉楠. 超高效液相色譜串聯(lián)質譜法對水產品中硝基呋喃代謝物的測定[J]. 河北漁業(yè)，2016（7）：47-51.

[14]Pereira A S，Pampana L C，Donato J L，et al. Analysis of nitrofuran metabolic residues in tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta，2004，514（1）：9-13.

[15]司紅彬，梁 軍. 硝基呋喃類藥物的殘留檢測（上）[J]. 獸醫(yī)導刊，2007（9）：48-49.

[16]譚志軍，翟毓秀，冷凱良，等. 呋喃西林和呋喃唑酮代謝物在大菱鲆組織中的消除規(guī)律[J]. 中山大學學報（自然科學版），2008，47（增刊1）：63-69.

[17]劉書貴，鄭光明，王 群，等. 呋喃唑酮代謝物在雜交鱧（斑鱧♀×烏鱧♂）體內的殘留消除規(guī)律[J]. 中國漁業(yè)質量與標準，2013，3（3）：248-253.