李美男

【摘要】目的：觀察狼毒總提取物對乳腺癌細胞增殖及周期影響。方法：CCK-8法測定該藥對MCF-7、MDA-MB-231、SK-Br-3細胞株增殖影響，流式細胞術檢測狼毒總提取物對MCF-7細胞周期影響。結果：狼毒總提取物對細胞IC50濃度分別為227ug/ml、793ug/ml、1034ug/ml。藥物作用隨著藥物濃度提高。MCF-7周期檢測，G0/G1期期比例下降、S期比例上升。結論：狼毒提取物對MCF-7、MDA-MB-231、SK-Br-3細胞生長均有抑制作用。主要研究了MCF-7細胞抑制機制，提示狼毒大戟總提取物抑制MCF-7細胞G₂/M期到G。/G₁其轉(zhuǎn)換。

【關鍵詞】狼毒大戟;乳腺癌;細胞增殖

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率增長逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢，預計2021年，中國乳腺癌發(fā)病率將位居腫瘤發(fā)病率的第二位，乳腺癌患者將高達250萬，嚴重威脅女性的身體健康。乳腺癌的發(fā)生跟人體內(nèi)激素水平、遺傳因素、飲食習慣、生殖因素等有關，占女性新發(fā)癌癥總數(shù)約25%，死亡率高，嚴重威脅了廣大女性的生命和健康。目前乳腺癌的西醫(yī)治療以手術治療、內(nèi)分泌治療、放射治療、分子靶向治療等為主要治療手段。但多數(shù)患者仍出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移、耐藥及放化療給患者帶來的不同程度毒副作用，因此利用中藥進行綜合調(diào)節(jié)治療也是近年來研究的熱點領域。中藥治療能夠有效地減輕患者的臨床癥狀，提高他們的生存質(zhì)量，并防止腫瘤細胞的復發(fā)轉(zhuǎn)移，同時還可以與放化療配合增效減毒。因此從天然產(chǎn)物中尋找抗腫瘤化合物己經(jīng)成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要方向。

狼毒大戟首記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，一般取其根部入藥，味辛、性平、有毒，入肺、肝經(jīng)，有逐水祛痰，散結殺蟲的功效?！侗窘?jīng)》中就有：“狼毒破積聚，治惡瘡，消盎毒”的論述。狼毒大戟含有多種黃酮類、二萜類、倍半萜類、香豆素類、木脂素類及苯丙素苷類等化學成分，現(xiàn)代藥理研究學表明，狼毒的水提液、醇提液或者不同種的炮制品均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。本實驗主要探討狼毒大戟對體外培養(yǎng)的不同類型的乳腺癌細胞的增殖影響。

1材料

1.1試劑與藥品

狼毒大戟總提取物由沈陽藥科大學藥學院提供。

1.1.1試劑

1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液購于Hyclone公司;胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、PBS購于Genvew公司;胎牛血清購于Clark公司;CCK-8試劑購于Vazyme公司;碘化丙錠溶液購于北京鼎國盛生物技術有限公司。

1.1.2瘤株

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231（三陰型）、MCF-7（luminal A型）、SK-BR-3（HER2陽性型）均購于中科院上海細胞庫。

1.2儀器

Thermo Scientific生物安全柜（購于美國公司Thermo Fisher Scientific公司）;二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo FisherScientific公司）;Olympus CKX31倒置顯微鏡（上海賴式電子科技有限公司）;ACCergraX-15R臺式冷凍離心機（美國Beckman coulter公司）;Mettler Toledo型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;FLUOstar Omega型多功能酶標儀（德國BMG公司）FACSCaulibur流式細胞儀（美國BD公司）。

2實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)

LminalB型人乳腺癌細胞MCF-7采用10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基、三陰型人乳腺癌細胞MDA-MB-231、Her-2陽型人乳腺癌SK-Br-2細胞采用15%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于5%C0₂，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2CCK-8

2.2.1收集細胞

將長至80%細胞消化離心，加入全培養(yǎng)液，細胞計數(shù)，每lOOul約6×10³個細胞，加細胞懸液100ul到96孔板（邊緣孔用無菌水或PBS填充），設置空白組（無細胞）和對照孔（培養(yǎng)基不加藥，有細胞）。置37℃，5%CO₂孵箱孵育過夜。

2.2.2加藥

取出96孔板，吸出培養(yǎng)液，每孔加入100uF孔狼毒總提取物，設置5個藥物濃度梯度，分別為1000ug/ml、500ug/ml、300ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、30ug/ml、10ug/ml、lug/ml、每個濃度5個復孔，于5%C0₂的培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃>條件下培養(yǎng)24h。

2.2.3CCK-8檢測OD值

每孔加入10ul CCK-8溶液，孵箱孵育2h后檢測，450nm各孔吸光值，計算OD值公式為細胞活性%=（加藥細胞OD-空白OD/對照細胞OD-空白OD）x100%。

2.3細胞周期

2.3.1收集細胞

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞的，以每個孔2x10⁶細胞密度接種于六孔板，孵箱孵育24h。

2.3.2加藥

每孔加入100ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的狼毒總提取物，設置陰性對照組（不加藥物不加PI染液）及空白組（不加藥物加PR染液）于5%CO₂，37℃孵育24h。

2.3.3染色流式儀檢測

將六孔板中細胞消化離心，用預冷PBS沖洗一遍，加入75%乙醇輕輕吹勻細胞，4℃過夜。3000轉(zhuǎn)10min離心，收集細胞，用預冷PBS吹洗1遍，加入碘化丙錠（PI染液）冰上孵育30min，PBS沖洗一遍，上機檢測。計算細胞周期。

3結果

3.1不同濃度藥物對乳腺癌細胞增殖的影響

不同濃度狼毒總提取物作用于乳腺癌細胞24h后，MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3，細胞增殖均有不同程度影響，其IC50分別為227ug/ml、793ug/ml、720ug/m1。對各種細胞系敏感程度排序為MCF-7>MDA-MB-23I>SK-BR-3。結果見表1、圖1。

3.2狼毒大戟對MCF-7增殖周期影響

不同藥物濃度作用后，低、中、高藥物濃度和陰性對照組G₁期細胞所占比分別為：68.92%、66.71%、64.6%、57.22%;G2期分別為12.65%、15.33%、19.1%、30.32%。結果見圖2。結果表明，隨之狼毒大戟總提取物濃度的增加，G₀/G₁其比例逐漸下降，G₂期上升，提示狼毒大戟總提取物抑制MCF-7細胞GJM期到G₀/G₁。其轉(zhuǎn)換。

4結論

狼毒大戟是大戟科狼毒屬植物，俗稱貓眼草，中醫(yī)記載其主要用于治療水腫腹脹、結核、蟲積疥瘡、積聚等疾病?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等作用。近幾年來對狼毒大戟提取物抗腫瘤的報道越來越多，狼毒大戟中主要有二萜類、黃酮類、香豆素類化合物、木脂體類等化學成分，楊瑾等研究表明，狼毒大戟提取物可以影響人肝癌細胞上皮間質(zhì)化。孟明靜等研究表明狼毒水煎液可抑制A549細胞生長，并對其遷徙也有一定影響。在臨床上，狼毒大戟干品制成的注射液，對肺癌、乳腺癌均有一定療效、楊德全用狼毒二鱉消積湯治療原發(fā)性肝癌3個月。結果表明：顯效9例，有效11例，無效5例，總有效率達80%。

由于狼毒大戟為中藥制劑，其成分復雜，本實驗選用了狼毒大戟總提取物為研究對象，試探討狼毒總提取物對乳腺癌的作用機制，CCK-8結果表明，狼毒總提取物對乳腺癌細胞的增殖有抑制作用，針對三種類型乳腺癌細胞，MCF-7對狼毒總提取物最為敏感，周期結果表明，狼毒總提取物作用于培養(yǎng)的MCF-7人乳腺癌細胞24h，使細胞周期阻止在G2/M期，本研究初步證明了狼毒大戟總提取物具有抗乳腺癌細胞的活性，并且是通過阻止細胞周期來影響細胞的增殖，但其具體機制還需進一步研究。