余 蕾， 趙雪紅， 樊小力， 朱娟霞， 李雪萍

(1. 西安醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 西安 710021； 2. 湖北文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院， 襄陽 441053； 3. 西安交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)部, 西安 710016)

制動是骨折患者最常見的治療方式，制動治療雖然可保護受損組織利于骨折的愈合，但限制了周圍健康關(guān)節(jié)、肌肉的運動，可使患者產(chǎn)生明顯的廢用性肌萎縮。研究發(fā)現(xiàn)，廢用條件下大鼠肌緊張減弱，出現(xiàn)肌肉萎縮，其中肌梭的萎縮比梭外肌出現(xiàn)的要早，其萎縮程度也較梭外肌更為嚴(yán)重，這提示肌梭在廢用性肌萎縮的發(fā)生發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，Na2ATP可使后肢制動一周的大鼠比目魚肌的離體單一肌梭放電明顯增加，起到對抗制動所致的廢用性肌萎縮的作用，然而其機制卻尚未明晰[1-4]。

Ca2+作為第二信使參與了肌肉收縮，腺體分泌，突觸傳遞，受精，轉(zhuǎn)錄調(diào)控等眾多生命活動的基本過程[5]。正常的肌肉收縮活動即由Ca2+觸發(fā)，鈣穩(wěn)態(tài)的維持對肌肉收縮功能具有重要作用，且Ca2+在肌梭電位的形成中起重要作用。鈣超載可促進氧自由基生成、引起線粒體功能障礙、并激活鈣依賴性的水解酶，從而誘發(fā)細胞凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)，在失重所致的廢用性肌萎縮早期即可見到肌細胞內(nèi)鈣增多現(xiàn)象，且隨失重時間延長而加重[6]。為研究制動情況下肌梭內(nèi)Ca2+濃度是否發(fā)生改變及Na2ATP增加肌梭放電的作用是否與Ca2+濃度的改變有關(guān)，本研究采用激光掃描共聚焦技術(shù)，觀測后肢制動一周比目魚肌梭內(nèi)肌細胞內(nèi)靜息Ca2+的變化，并以Na2ATP作為對抗措施，觀察其對后肢制動大鼠梭內(nèi)肌細胞Ca2+的影響。為研究鈣超載在廢用性肌萎縮發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，并尋找有效的對抗措施提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥品

實驗動物選用無疾病、健康活潑的SD品系雄性大鼠，體重220～250 g，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。根據(jù)體重配對原則，實驗動物被隨機分為正常對照組、制動組、制動+0.05 mg/d Na2ATP組(Na2ATP0.05)、制動+0.1 mg/d Na2ATP組(Na2ATP 0.1)、制動+0.15 mg/d Na2ATP組(Na2ATP 0.15)，每組動物6只，每只動物左右后肢各取肌梭一個，每組肌梭樣本為12個。制動+Na2ATP組每天給予相應(yīng)濃度的Na2ATP 肌肉注射。

Fluo-3/AM 原液：將0.5 mg Fluo-3/AM 粉末避光溶于0.5 mL的二甲基亞砜(DMSO)，分裝后-20 ℃避光存放備用。使用時，用Hanks′液稀釋Fluo-3/AM 原液至濃度為10 μmol/L即可。

1.2 大鼠后肢制動模型建立

實驗采用改良Booth等的方法[7]建立大鼠后肢制動模型。大鼠經(jīng)0.4 g/kg水和氯醛腹腔注射麻醉后清潔其左后肢，在左后肢上包裹一層輕薄的棉花，尤其注意關(guān)節(jié)及血管等處防止這些部位受到石膏壓迫，而后將石膏繃帶置于棉花上纏繞包裹左后肢，繃帶松緊適宜，由踝關(guān)節(jié)起向上經(jīng)膝關(guān)節(jié)纏繞至腹股溝處，注意固定過程中膝關(guān)節(jié)處于伸展?fàn)顟B(tài)，踝關(guān)節(jié)處于背伸狀態(tài)，最終使左后肢固定于靜息位一周。石膏外側(cè)包繞銅網(wǎng)，防止動物撕咬。室溫維持在25 ℃左右，將大鼠置于鼠籠內(nèi)喂養(yǎng)，一鼠一籠，保證大鼠正常飲水進食以及活動。

1.3 大鼠比目魚肌單一肌梭標(biāo)本的制備

使用烏拉坦(1.5 g/kg) 腹腔注射麻醉大鼠，分離并取出一側(cè)比目魚肌，置于Leiboviz′s 15 (L-15)培養(yǎng)基中[8]，持續(xù)通氧。以聚光燈為光源，在雙目解剖顯微鏡和倒置顯微鏡下，利用分離針分離肌梭。因肌梭與梭外肌平行排列，分離時應(yīng)沿著肌肉長軸逐步剝離肌梭周圍的梭外肌、血管等組織，直至分離出完整的肌梭，注意保持肌梭形態(tài)完整和梭囊表面光滑。將分離出的肌梭平鋪展開，并貼于改良的細胞培養(yǎng)盒底部的經(jīng)明膠-多聚賴氨酸處理過的載玻片上。

1.4 比目魚肌梭內(nèi)肌纖維Ca2+熒光強度的測量

將Fluo-3/AM原液用Hanks′液避光稀釋為終濃度10 μmol/L，加入盛有肌梭樣本的培養(yǎng)盒，常溫避光孵育45 min后，用Hanks′液沖洗2遍。隨后在激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica，TCS Sp2，Germany)下觀察標(biāo)本，設(shè)置激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為550 nm，調(diào)整顯微鏡聚焦，對肌梭標(biāo)本進行觀察。設(shè)置掃描參數(shù)，每30 s掃描1次，連續(xù)掃描10 min，觀察梭內(nèi)肌纖維Ca2+熒光強度的變化。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

正常對照組：實驗選取12例肌梭標(biāo)本，激光共聚焦顯微鏡下可見大鼠比目魚肌梭呈現(xiàn)一定的熒光強度，熒光在肌梭梭囊以及梭內(nèi)肌纖維均有分布，其中梭內(nèi)肌纖維熒光呈均勻分布。其MFI為54.82±6.38(見圖1)。

制動組：實驗選取12例肌梭標(biāo)本，激光共聚焦顯微鏡下可見熒光均勻分布于梭內(nèi)肌纖維，其MFI為88.64±7.12。與正常對照組相比，MFI明顯增加(P<0.05),見圖1和圖2。

制動+0.05 mg/d Na2ATP組：實驗選取12例肌梭標(biāo)本，激光共聚焦顯微鏡下可見熒光均勻分布于梭內(nèi)肌纖維，其MFI為83.17±6.43，與制動組相比未見明顯減少，與正常對照組相比MFI明顯增加(P<0.05)，見圖1。

制動+0.1 mg/d Na2ATP組：實驗選取12例肌梭標(biāo)本，激光共聚焦顯微鏡下可見熒光均勻分布于梭內(nèi)肌纖維，其MFI為70.03±5.75。與制動組相比MFI明顯減少(P<0.05)，與正常對照組相比MFI明顯增加(P<0.05)，與制動+0.05 mg/d Na2ATP組相比MFI明顯減少(P<0.05)，見圖1和圖2。

1：正常對照組；2：制動組；3：制動+0.5 mg/d Na2ATP;4：制動+0.1 mg/d Na2ATP;5：制動+0.15 mg/d Na2ATP?！?”：P<0.05，compared with CON； “#”：P<0.05，compared with hindlimb immobilization；“Δ”：P<0.05，compared with Na2ATP 0.05

圖1制動及Na2ATP對大鼠比目魚肌梭內(nèi)肌細胞Ca2+的影響

Figure 1 Effects of hindlimb immobilization and Na2ATP on intrafusal Ca2+in soleus muscle cells of rats

制動+0.15 mg/d Na2ATP組：實驗選取12例肌梭標(biāo)本，激光共聚焦顯微鏡下可見熒光均勻分布于梭內(nèi)肌纖維，其MFI為67.59±7.41。與制動組相比MFI明顯減少(P<0.05)，與正常對照組相比MFI明顯增加(P<0.05)，與制動+0.05 mg/d Na2ATP組相比，MFI明顯減少(P<0.05)，與制動+0.1 mg/d Na2ATP組相比無明顯變化(見圖1)。

A：正常對照組； B：制動組； C：Na2ATP0.1組

圖2大鼠比目魚肌梭內(nèi)肌細胞Ca2+熒光共聚焦顯微圖像

Figure 2 The laser confocal microscopic images of calcium fluorescence in intrafusal muscle cells of rat′ soleus muscles

3 討論

Ca2+觸發(fā)了骨骼肌細胞的興奮-收縮耦聯(lián)，從而啟動了肌肉收縮的過程，它同時還作為第二信使參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)代謝等多種細胞功能。Ca2+還極可能參與了細胞增殖的啟動過程，通過上調(diào)c-myc、c-fos，肌細胞有絲分裂明顯增加，肌細胞肥大、增生，甚至影響肌細胞蛋白表型轉(zhuǎn)換和幼稚型骨骼肌的生長[9-11]。細胞內(nèi)存在一種鈣結(jié)合蛋白，可以與胞內(nèi)的游離Ca2+結(jié)合，從而降低細胞內(nèi)的游離Ca2+濃度，起到緩沖及對抗胞內(nèi)鈣超載的作用。研究發(fā)現(xiàn)，僅在模擬失重3 d時，梭內(nèi)、外肌纖維胞漿游離Ca2+濃度即明顯增多，且隨模擬失重時間的延長而加重；至模擬失重14 d，肌細胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象，并可見到梭內(nèi)肌纖維中鈣結(jié)合蛋白D-28K的表達明顯減少，與胞漿游離Ca2+的結(jié)合減弱，細胞抵抗鈣超載的毒性作用減弱。

肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的維持為肌肉收縮舒張功能的實現(xiàn)提供了保障，骨骼肌細胞胞漿鈣穩(wěn)態(tài)失衡時，尤其是胞漿Ca2+濃度過度增加或持續(xù)性增加，可通過激活磷脂酶水解生物膜的骨架成分，增加生物膜的通透性。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔大量開放，線粒體釋放細胞色素C，Caspase-9、Caspase-3相繼激活，啟動了線粒體凋亡程序；同時通過激活半胱氨酸蛋白酶Calpain及依賴ATP的泛素-蛋白酶水解系統(tǒng)分解肌絲蛋白、肌節(jié)蛋白titin、肌原纖維蛋白、結(jié)蛋白desmin、抗肌營養(yǎng)不良蛋白dystrophin等，并將其降解成氨基酸，引發(fā)肌細胞超微結(jié)構(gòu)紊亂、肌小節(jié)結(jié)構(gòu)改變，從而影響肌肉的收縮與舒張功能。

Fluo-3/AM是一種對Ca2+敏感的熒光探針，它可通過細胞膜進入細胞，繼而與胞漿中的游離Ca2+結(jié)合，并且在激發(fā)光的作用下顯示熒光，其熒光強度與細胞內(nèi)游離Ca2+濃度成正比，因此實驗所測得的熒光強度可真實地反映細胞內(nèi)游離Ca2+的濃度。本實驗發(fā)現(xiàn)后肢制動一周大鼠比目魚肌梭內(nèi)肌細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，這與模擬失重可致骨骼肌鈣超載的報道一致。實驗分別給予了低、中、高3種濃度的Na2ATP，低濃度(0.05 mg/d)Na2ATP對制動所致的肌梭內(nèi)Ca2+濃度升高未見明顯改善，而經(jīng)中、高濃度(0.1、0.15 mg/d)Na2ATP治療后制動大鼠比目魚肌肌梭Ca2+濃度升高幅度明顯減少，說明一定濃度的Na2ATP有對抗制動所致的肌梭內(nèi)鈣超載的作用。實驗中測得標(biāo)準(zhǔn)誤較大，這主要與肌梭個體差異性有關(guān)，每個肌梭內(nèi)所含的梭內(nèi)肌纖維數(shù)目、大小以及活性不盡相同，這就決定了梭內(nèi)肌纖維內(nèi)Ca2+熒光強度不同。

Na2ATP減弱制動大鼠比目魚肌梭內(nèi)肌細胞Ca2+濃度升高現(xiàn)象，可能與以下因素有關(guān)：1)Na2ATP可以提高肌漿網(wǎng)鈣泵對Ca2+的攝取，使胞漿內(nèi)游離Ca2+向肌漿網(wǎng)轉(zhuǎn)移，從而降低了胞漿游離Ca2+濃度，熒光強度減弱；2)Na2ATP可使神經(jīng)肌肉接頭處突觸前膜內(nèi)的遞質(zhì)Ach釋放增多，Ach擴散至終板膜與其受體結(jié)合，可提高終板膜對Ca2+的通透性，觸發(fā)Ca2+內(nèi)流[15]，胞漿內(nèi)游離Ca2+減少。研究發(fā)現(xiàn)，在失重所致廢用性肌萎縮發(fā)生過程中，可見骨骼肌的等長收縮持續(xù)時間減少，間斷強直收縮的舒張時程、峰張力時間和半舒張時間減小，這與肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放和再攝取的數(shù)量與速度的改變有關(guān)[16]。而Na2ATP可通過提高肌質(zhì)網(wǎng)釋放和再攝取Ca2+的速率，提高肌肉的工作能力。另有研究表明，當(dāng)被稱為腫瘤抑制器的叉頭轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a活化時，MAFbx表達上調(diào)，從而引起肌萎縮。外源性ATP可促使FoxO3a磷酸化，MAFbx表達下調(diào)，起到緩解肌萎縮的作用[17]。

本研究采用激光掃描共聚焦技術(shù)，觀測后肢制動一周比目魚肌梭內(nèi)肌細胞內(nèi)靜息Ca2+的變化，結(jié)果表明后肢制動可致大鼠比目魚肌肌梭鈣超載，給予Na2ATP治療，可減輕梭內(nèi)肌細胞鈣超載的情況。本實驗研究了鈣超載在廢用性肌萎縮發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，并為尋找有效的對抗措施提供了實驗數(shù)據(jù)。