周齊洋, 黃建榮, 陳祥, 王春新

(1. 江蘇省醫(yī)療器械檢驗所, 南京 210019； 2. 無錫市人民醫(yī)院, 無錫 214000； 3. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室， 無錫 214122)

人血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)是一組由同一基因編碼的多形性蛋白，廣泛地存在于各種脊椎動物中[1-2]。目前為止，共發(fā)現(xiàn)4種蛋白亞型，其中SAA1和SAA2蛋白結構93%一致，在炎癥的急性期顯著上調；SAA3為假基因，不能轉錄和表達蛋白；SAA4蛋白不參與急性炎癥反應。在正常及炎癥狀態(tài)下，SAA1亞型為SAA蛋白的主要組分，決定著總SAA的水平[3]。血清SAA是一種敏感的急性期反應蛋白，正常情況下血漿中的含量極少，當機體受到細菌、支原體等抗原刺激后，在5～6 h內迅速升高約1000倍[4]。SAA還與高密度脂蛋白有關，它能在炎癥期間調節(jié)高密度脂蛋白的代謝；其降解產(chǎn)物能以淀粉樣蛋白A原纖維的方式沉積在不同的器官中，在慢性炎癥疾病中產(chǎn)生嚴重的并發(fā)癥。也有大量報道認為血清SAA水平可以作為評估和預測冠心病病情嚴重程度的敏感標志物[5-6]。隨著該標志物的廣泛研究和應用，其血清含量的檢測方法及性能越來越受到重視。

目前血清SAA的檢測方法主要為散射比濁法及膠乳免疫比濁法，該方法靈敏度較低，有一定的局限性。而化學發(fā)光免疫分析法因具有化學發(fā)光的靈敏度高、線性范圍大和重復性好等優(yōu)勢，已成為體外診斷試劑的主流方法之一。

目前國內還鮮有關于SAA的化學發(fā)光檢測方法的相關報道。本研究旨在采用雙抗夾心法，建立一種高靈敏度、高重復性、高準確度的血清SAA化學發(fā)光檢測方法。研究中使用了生物素-鏈霉親和素信號放大的微孔包被板，將稀釋后的含SAA的血清樣本、生物素化抗體、酶結合抗體加入至孔內，孵育后洗滌去除雜質，加入發(fā)光底物，根據(jù)樣本及校準曲線的光信號值計算相應樣本中SAA的濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

化學發(fā)光板購于美國Costar公司。血清淀粉樣蛋白A購于上海普欣；血清淀粉樣蛋白A抗體對購于Meridian。150例人血清樣本來自于無錫市人民醫(yī)院；生物素化標記試劑購于Thermo Fisher；參比試劑為西門子醫(yī)學診斷產(chǎn)品(上海)有限公司生產(chǎn)的血清淀粉樣蛋白A 測定試劑盒(散射比濁法)。

1.2 儀器

安圖公司產(chǎn)化學發(fā)光免疫分析儀，型號為LUMO。洗板機購于英國Anthos公司，型號為Fluido2。平板震蕩儀購于上海漢林，型號為Mix-1500。生化培養(yǎng)箱購于上海坤天實驗儀器有限公司，型號為SPX-80B。Quawell公司產(chǎn)超微量紫外分光光度計，型號為Q5000。

1.3 方法

1.3.1 包被板的制備

1)制備生物素化牛血清白蛋白(BSA-Biotin)。取10 mg BSA，加入到1 mL的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)中，加入1.69 mg生物素(分子量為556.59，間隔臂為22.4 ?)，充分混勻，室溫偶聯(lián)1 h。將標記好的生物素化牛血清白蛋白加入到Thermo脫鹽柱中純化脫鹽，用磷酸緩沖液作為洗脫液，去除游離的生物素。

2)包被。用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將上述Biotin-BSA稀釋成6 μg/mL的包被液，每孔100 μL，4℃過夜。將包被液倒去，用洗液洗滌3次。加入15 μg/mL的鏈霉親和素，每孔100 μL，室溫孵育2 h。倒去孔內溶液后加入封閉液(含2% BSA的磷酸緩沖液)，200 μL每孔，室溫孵育2 h。將封閉液傾去，晾干包被板。

1.3.2 生物素化抗體制備與純化

取1 mg包被抗體，用脫鹽柱更換緩沖液為磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)，最后收集到約1 mL的抗體溶液。準確稱取NHS-LC-LC-Biotin 1 mg至1 mL的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)中。量取100 μL的NHS-LC-LC-Biotin溶液加入至抗體溶液中，充分混勻，室溫反應1 h。

將上述標記好生物素的抗體加入到脫鹽柱純化去除雜質。收集生物素抗體，測量生物素抗體在280 nm處的吸光度，計算蛋白回收率為91%。并以HABA試劑檢驗偶聯(lián)率為7.2。

1.3.3 酶結合抗體制備與純化

稱取HRP溶于去離子水中，加入NaIO4(0.1 mol/L)溶液，室溫條件避光攪拌20 min后將反應物于4 ℃冰箱中用醋酸鈉溶液(1 mmol/L, pH 4.4)透析過夜，再加入4 μL乙二醇，室溫避光反應30 min。加入SAA標記抗體，于碳酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 9.5)中4 ℃避光透析過夜，結合物加入0.1 mL NaBH4，混勻，4 ℃避光反應2 h，攪拌狀態(tài)下加入等體積的飽和硫酸銨，4 ℃放置1 h， 5000 r/min離心15 min，棄上清。沉淀用PBS溶解，加入等體積甘油于-20 ℃保存[7]。

1.3.4 校準品的配制

用標準品稀釋液(含2%人血清白蛋白，0.5%的2-氯乙酰胺，pH 7.6的磷酸緩沖液)將SAA抗原稀釋成濃度分別為800、200、50、10、5和0 ng/mL的校準品溶液，分裝，并于-80 ℃凍存。

1.3.5 生物素化抗體及酶結合抗體工作濃度的確定

采用棋盤滴定法[8]。以校準品1信號值較低且校準品6/校準品1比值最高時對應的濃度為最佳工作濃度。

1.3.6 反應時間確定

使用優(yōu)化后的酶標抗體和生物素標記抗體濃度進行實驗，以信號值基本接近或達到最高點，且重復性較好的反應時間為最佳反應時間。

1.3.7 實驗原理及步驟

采用雙抗體夾心法測定血清中SAA含量。首先將樣本稀釋400倍，在預包被了鏈霉親和素的微孔板中，加入50 μL校準品或稀釋后的血清樣品后，再各加入50 μL生物素化抗體及酶結合抗體，混合后37 ℃孵育10 min，使生物素化抗體、SAA及酶結合抗體形成免疫復合物并與包被板上的鏈霉親和素結合，洗滌去除未結合的雜質，加入100 μL化學發(fā)光底物后，用化學發(fā)光儀進行檢測，根據(jù)樣本及校準曲線的光信號值計算相應樣本中SAA的濃度。

1.3.8 方法學評價

1)線性范圍。取一份高值血清樣本，用低值樣本稀釋成11個不同濃度，檢測前進行400倍稀釋后的濃度分別為822.42、412.84、206.58、104.92、54.08、28.67、15.96、9.60、6.43、4.84和3.25 ng/mL，各重復3次檢測，取平均值。以樣本濃度為X軸，以發(fā)光值為Y軸繪制曲線，取曲線擬合較好的區(qū)間為本方法的線性范圍。

2)最低檢測限。對校準品稀釋液重復檢測20次，計算20次發(fā)光值的平均值M和標準差SD，將M+2SD帶入校準曲線方程，計算得到濃度值即為最低檢測限。

3)準確度。對高值質控品和低值質控品分別重復檢測3次，測量濃度結果的平均值記為(Mi)，根據(jù)公式(1)分別計算相對偏差(Bi)

Bi(%)=(Mi-T)/T×100%

(1)

式中：Bi為相對偏差；Mi為測量濃度的平均值；T為標定濃度。

4)精密度。取3批試劑盒，分別對高值質控品和低值質控品重復檢測10次，計算CV=平均值/標準差。

5)加速穩(wěn)定性。取同批次3盒試劑盒，置于37 ℃恒溫箱中，分別在第1天、第4天及第7天取樣，在第7天與4 ℃同批次試劑盒同時檢測，以4 ℃同批次試劑盒為對照，考察質控品濃度偏差。

6)方法學對比。無錫市人民醫(yī)院檢驗科選取覆蓋線性范圍的150例臨床血清，分別用本文方法和西門子醫(yī)學診斷產(chǎn)品(上海)有限公司生產(chǎn)的血清淀粉樣蛋白A 測定試劑盒(散射比濁法)同時進行檢測，并對血清檢測結果進行統(tǒng)計學相關性分析。

2 結果

2.1 生物素化抗體及酶結合抗體工作濃度的確定

根據(jù)校準品1信號值較低且校準品6/校準品1比值最高的綜合結果(表1)，確定生物素化抗體濃度為2 μg/mL，酶結合物抗體濃度為2 μg/mL。

表1 生物素化抗體和酶結合抗體工作濃度

2.2 反應時間確定

結果(表2和表3)表明，孵育10 min，信號值已基本達到最高值，且重復性較好，因此確定孵育時間為10 min。

表2 不同孵育時間對發(fā)光值的影響

表3 不同孵育時間對血清重復性的影響

2.3 線性范圍

當試劑在3.25～822.42 ng/mL范圍內時，劑量-反應曲線的線性良好，故確定檢測方法的線性范圍為5～800 ng/mL。

2.4 最低檢測限

通過計算20份校準品稀釋液的信號值結果，將M+2SD帶入校準曲線方程，計算得到濃度值1.64 ng/mL。故擬定本方法最低檢測限為3 ng/mL。

2.5 準確度

實驗結果表明高低濃度質控品實測濃度與理論值之間的相對偏差絕對值分別為6.90%和2.83%，表明本方法檢測準確性較高，見表4。

表4 準確度檢測結果

2.6 精密度

3批次試劑盒各對低值質控品檢測10次，批內變異系數(shù)分別4.8%、4.7%和2.3%，批間變異系數(shù)為4.2%。由此說明本試劑盒檢測結果穩(wěn)定，重復性好(見表5)。

表5 精密度檢測結果

2.7 加速穩(wěn)定性

檢測結果(表5)顯示試劑盒在37 ℃放置不同時間和4 ℃相比，質控品濃度偏差均小于10%，說明本試劑穩(wěn)定性良好，結果見表6。

表6 加速穩(wěn)定性試驗結果

圖1本法與西門子檢測結果相關性

Figure 1 Linear correlation between the prepared method and Siemens kit

2.8 方法學相關性的比較

同時用本法與西門子試劑盒檢測臨床血清150份血清樣本。分析計算相關系數(shù)r2=0.98，表明兩種檢測方法相關性較好(圖1)。

3 討論與結論

在目前的臨床應用中，與C反應蛋白 (CRP) 類似，對血清淀粉樣蛋白 A 的檢測，有助于診斷炎癥，同時檢測 C 反應蛋白和血清淀粉樣蛋白 A 能提高對感染的診斷靈敏度[9]，但血清淀粉樣蛋白 A 檢測在診斷發(fā)生病毒感染、腎移植排斥反應的患者(特別是進行免疫抑制治療的患者)以及用腎上腺皮質激素治療的囊性纖維化患者方面，比 C 反應蛋白檢測更確鑿[10-11]。隨著科研水平的進步，SAA標志物與疾病的關聯(lián)報道越來越多，其診斷意義也越發(fā)顯得重要。

本研究采用雙抗夾心法原理，通過生物素-鏈霉親和素的信號放大系統(tǒng)對血清淀粉樣蛋白A進行定量檢測。首先對重要原材料進行標記并通過棋盤滴定法確定其工作濃度，并對其反應體系進行優(yōu)化；再對建立的方法做了相應的性能評估；最后將建立的方法與進口試劑盒進行臨床樣本測試比對。結果表明本研究建立的檢測方法靈敏度、準確性、精密度以及穩(wěn)定性等均能達到臨床需求，該方法可為疾病診斷、預測以及治療效果的判斷提供客觀診斷依據(jù)，同時也填補了目前國內相關研究的空白。