李艷宇 李?yuàn)檴?高鵬 彭曉旻

流感病毒依據(jù)內(nèi)部核蛋白(NP)與基質(zhì)蛋白(MP)的抗原性差異，可被分為甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)三個(gè)型。甲型和乙型流感病毒是人群中主要的流行病毒，是引起人群呼吸道感染的主要病原體。乙型流感病毒雖然未造成過(guò)流感大流行，但同甲型流感病毒一樣每年在全球季節(jié)性流行，導(dǎo)致了各地的局部流行，并能引起重癥和死亡病例，在某些特定情況下所導(dǎo)致的疾病負(fù)擔(dān)甚至超過(guò)甲型流感病毒[1-3]。乙型流感病毒屬于正黏病毒科(orthomyxoviridae)，本研究用乙型流感病毒快速檢測(cè)方法與實(shí)時(shí)熒光參考方法進(jìn)行比較，擬評(píng)估乙型流感病毒快檢試劑盒在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的適用性及應(yīng)用效果，為臨床推廣提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1評(píng)估樣本來(lái)源 2015年10月-2017年5月，以北京市東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心(CDC)收集到的216例流感樣病例的咽拭子標(biāo)本作為本次評(píng)估的臨床樣本，其中，流感樣病例定義為發(fā)熱(體溫≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。

1.2標(biāo)本采集、保存和運(yùn)輸 用無(wú)菌咽拭子在患者咽后壁左右擦拭至少2次，然后將其放置病毒采樣管中，4 ℃條件下運(yùn)輸。24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)則放置2～8 ℃條件下，超過(guò)24 h檢測(cè)則需要放置-80 ℃凍存。

1.3評(píng)估試劑及操作步驟 乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒(免疫滲漏法)為北京萬(wàn)泰生物公司產(chǎn)品(貨號(hào)為：Flu-0330)。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。操作過(guò)程中應(yīng)注意：(1)在樣本處理時(shí)，加入裂解液后一定要充分混勻，使樣本充分裂解。(2)加酶標(biāo)試劑后一定要等酶標(biāo)試劑完全滲入后再靜置2 min進(jìn)行下一步操作，使酶作用時(shí)間充足。

1.4參照方法及檢測(cè)流程 以中國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦的乙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光PCR方法作為對(duì)照方法。檢測(cè)流程：(1)引物與探針序列：FluB-F：TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG；FluB-R：CGGTGCTC-TTGACCAAATTGG；FuB-P：CCAATTCGAGCAGCTGAA-ACTGCGGTG。(2)體系配制采用QIAGEN的Quantitect?Probe RT-PCR kit：貨號(hào)為204445。(3)上機(jī)程序：設(shè)置FAM熒光通量，反轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15Sec、60 ℃ 60Sec(40個(gè)循環(huán)，并在60 ℃收集熒光)。(4)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：以陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線作為基線調(diào)整依據(jù)，閾值循環(huán)數(shù)Ct(cycle threshold)值<30為陽(yáng)性；Ct值>32為陰性；Ct值在30～32之間為灰區(qū)，重新檢測(cè)后Ct值仍在30～32之間判為陽(yáng)性。

1.5分析方法 臨床試驗(yàn)采用樣本隨機(jī)盲法排序。(1)在測(cè)定過(guò)程中，對(duì)同一份標(biāo)本分別用乙型流感病毒抗原快檢試劑盒(免疫滲漏法)和參照方法平行測(cè)定，分別記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)將兩種檢測(cè)方法均為陽(yáng)性且Ct值較低(Ct值>29)的樣本按照10倍梯度稀釋10-1～10-4，然后再用快檢方法與參考方法分別對(duì)各個(gè)稀釋度的樣本進(jìn)行平行測(cè)定，分別記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)2×2列聯(lián)表，用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Kappa值檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)快檢方法與參考方法的一致性(Kappa值為內(nèi)部一致性系數(shù)，是評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)方法與金標(biāo)準(zhǔn)一致性指標(biāo)。判別標(biāo)準(zhǔn)為：Kappa值≥0.75說(shuō)明兩個(gè)判斷值具有良好的一致性； Kappa值>0.4，說(shuō)明兩個(gè)判斷值一致性尚可； Kappa值≤0.4說(shuō)明兩個(gè)判斷值一致性較差；)，兩種檢測(cè)方法間的差異用Fisher檢驗(yàn)；同時(shí)評(píng)價(jià)快檢試劑的靈敏度、特異性、總符合率指標(biāo)。靈敏度=真陽(yáng)性份數(shù)/(真陽(yáng)性份數(shù)+假陰性份數(shù))×100%，特異性=真陰性份數(shù)/(真陰性份數(shù)+假陽(yáng)性份數(shù))×100%，總符合率=(真陽(yáng)性份數(shù)+真陰性份數(shù))/總份數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1快檢方法與參考方法檢測(cè)結(jié)果的比較 用乙型流感病毒快檢方法與實(shí)時(shí)熒光參考方法同時(shí)檢測(cè)臨床216份流感樣病例樣本，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示 Kappa值為0.91，表明兩種檢測(cè)方法的一致性良好，F(xiàn)isher檢驗(yàn)P=8.44E-17，P<0.001，兩種檢測(cè)方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中快檢方法的靈敏度為84.62%(11/13)，特異性為100%(203/203)，總符合率為99.07%(214/216)。兩種方法均表現(xiàn)為陽(yáng)性的人數(shù)為11份(8份為快檢陽(yáng)性參考方法檢測(cè)Ct值<30，3份為快檢陰性參考方法檢測(cè)兩次Ct值都在30～32之間)，有2份樣本快檢方法檢測(cè)為陰性而參考方法檢測(cè)為陽(yáng)性(參考方法兩次檢測(cè)Ct值都在30～32之間,表1)。

2.2快檢方法與參考方法檢測(cè)限度的比較 兩種檢測(cè)方法均為陽(yáng)性且Ct值較低(Ct值>29)的5份流感樣病例樣本稀釋后再用乙型流感病毒快檢方法與實(shí)時(shí)熒光參考方法同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果顯示有4份樣本檢測(cè)陽(yáng)性限度相差10倍，1份樣本檢出陽(yáng)性限度相差100倍，第5件樣本在稀釋度為10-3時(shí)兩種檢測(cè)方法均為陰性(其樣本Ct值最高為31.57,表2)。

表2 快檢方法與參考方法檢測(cè)限度比較

注：“+”表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；“-”表示檢測(cè)結(jié)果為陰性。

3 討論

3.1結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙型流感病毒快速檢測(cè)試劑與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法比較，也能高特異、高敏感地檢測(cè)出乙型流感病毒感染，并且與對(duì)照試劑有著較高的符合率，說(shuō)明乙型流感病毒快檢試劑也可以滿足乙型流感病毒臨床檢測(cè)的一般需要。本研究中雖然只有2份樣本呈現(xiàn)假陰性結(jié)果，但由于近幾年乙型流感病毒病例相對(duì)較少，只有13份陽(yáng)性樣本，所以漏檢率較高，靈敏度相對(duì)較低，防止出現(xiàn)這種偏倚的方法一方面需要選擇在乙型流感流行的年度加大檢測(cè)樣本，提高乙型流感病毒的陽(yáng)性率，另一方面是快檢試劑本身質(zhì)量的優(yōu)化，縮短樣本裂解時(shí)間，降低樣本檢出濃度限度，提高試劑的靈敏度和特異性。

3.2由于無(wú)合適的方法對(duì)樣本中病毒載量進(jìn)行絕對(duì)定量，只能對(duì)原始樣本進(jìn)行相應(yīng)的梯度稀釋后再用兩種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估快檢方法的檢測(cè)限度。通過(guò)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，快檢方法與參考方法的檢測(cè)限度一般只相差10倍(只有一份樣本相差100倍)，說(shuō)明快檢方法的檢測(cè)限度也較低，與普通PCR方法相當(dāng)[4-7]。但快檢試劑對(duì)樣本的檢出限度值與參考試劑檢測(cè)樣本的Ct之間是否存在線性關(guān)聯(lián)還需要進(jìn)一步研究。

與參考試劑相比，快檢試劑有著檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、不需要檢測(cè)儀器等諸多優(yōu)點(diǎn)，其特異性和靈敏度較高，可為臨床醫(yī)生對(duì)乙型流感病毒感染及病毒性肺炎的病原學(xué)診斷、制定診療方案提供幫助。