梁倩 李海 解繼勝 黃凌凌 顧建忠 黎飚 楊潔 方曉燕

(右江民族醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,廣西 百色 533000)

絕經(jīng)后不僅雌激素分泌較少，還會(huì)導(dǎo)致護(hù)骨素(OPG)水平下降，核因子-κB 受體活化因子配體(RANKL)水平升高及血清堿性磷酸酶(ALP)活性升高。這些影響骨代謝因子改變，即OPG降低，RANKL和ALP升高導(dǎo)致成骨功能下降破骨胞功能上升，引起骨質(zhì)流失，骨皮質(zhì)變薄，骨小梁變小、斷裂，稀疏變脆，易于骨折。雌激素防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)效果不錯(cuò)，但毒副作用令人擔(dān)憂(yōu)〔1,2〕?，F(xiàn)在人們把希望寄托在有雌激素樣作用，又無(wú)其副作用的植物性雌激素，比如：葛根和山茶籽等提取物身上。本實(shí)驗(yàn)主要探討葛根素對(duì)PMOP大鼠血清OPG、RANKL及骨組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 5月齡SD雌性大白鼠(320～350g)96只，廣西百色榨油后的山茶籽茶麩，經(jīng)脫脂后乙醇提取，并低溫濃縮為8.6 g/g的濃度，提取物保存于低溫冰箱，溫度在2～5℃，用藥的時(shí)候再把提取物稀釋至5 g/g濃度。雌二醇(E2)針劑 (每支100 μg，武漢峰耀同輝化學(xué)制品有限公司,批號(hào)：20173086)。OPG和RANKL試劑盒購(gòu)于上海博湖生物科技有限公司，ALP試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠分組 大鼠分成假切除卵巢(Sham)組、PMOP大鼠(OVX)組、E2治療(E2)組、山茶籽治療(Ts)組4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組24只，按常規(guī)籠養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自動(dòng)給水。

1.3 PMOP模型制備及給藥 除Sham組外，其余組均進(jìn)行PMOP模型制備，用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，濃度為10 g/L，劑量為3.0 mg/kg，消毒注射部位后注射麻藥，待大鼠麻醉進(jìn)入可手術(shù)狀態(tài)后無(wú)菌條件下從背部雙側(cè)分別切開(kāi)切口進(jìn)入腹腔，分別摘除兩側(cè)卵巢，小心細(xì)針細(xì)線(xiàn)縫合切口。切口縫合后用75%酒精消毒，再擦上少許注射用慶大霉素液。摘除卵巢塊經(jīng)過(guò)切片鏡下鑒定為卵巢。術(shù)后連續(xù)3 d用慶大霉素液涂擦手術(shù)切口，以防切口感染。造模術(shù)后7 d后用藥干預(yù)。Sham組手術(shù)方法和步驟與切除卵巢術(shù)一樣，不同的是：摘除不是卵巢，而是附在卵巢旁邊一個(gè)脂肪塊。Ts組：將原來(lái)準(zhǔn)備好的濃度為8.6 g/g的山茶籽醇提物濃縮液用滅菌0.9%生理鹽水稀釋濃度為5 g/g的山茶籽醇提物灌胃液，用量為10 ml/(kg·d)。E2組：用E2注射液皮下注射，劑量按200 μg/kg，注射完畢，注射針口處用棉簽按壓2 min， 2次/w。Sham組：0.9%生理鹽水滅菌后進(jìn)行灌胃，與Ts組等容量灌胃。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 (1)各組實(shí)驗(yàn)鼠左股骨頭1 cm取材和切片觀察：盡可能剝離干凈左側(cè)股骨頭軟組織，取股骨頭近端1 cm長(zhǎng)度。及時(shí)固定(固定液為10%甲醛)、脫鈣后按酒精梯度濃度順序進(jìn)行脫水、石蠟熱熔至液態(tài)下包埋，包埋石蠟塊完成冷硬后用自動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行切片，染色組織片光鏡200倍下觀察其結(jié)構(gòu)并拍照保存。(2)各組OPG、ALP、RANKL測(cè)定：第2、6、 8和12 w分別取6只大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，方法同1.3。在麻醉狀態(tài)下打開(kāi)胸腔吸取左心血5 ml。4 000 r/min離心10 min獲取沉淀，取上層血清，-20℃保存待測(cè)。按試劑盒說(shuō)明測(cè)定OPG、ALP及RANKL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SSPS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組股骨頭鏡下組織結(jié)構(gòu)比較 Sham組股骨頭周?chē)瞧べ|(zhì)厚而致密，骨髓腔大小適中，骨皮質(zhì)小粱大小、粗細(xì)、排列規(guī)律正常，骨細(xì)胞大小正常，位于骨陷窩內(nèi),骨細(xì)胞與骨陷窩壁鑲貼緊密,沒(méi)有空洞。OVX組股骨頭周?chē)瞧べ|(zhì)變薄，股骨頭的骨皮質(zhì)小梁變小變短，骨小梁與骨小梁之間間隙明顯比其他3組增大。骨細(xì)胞萎縮變小，骨細(xì)胞與骨陷窩壁間隙明顯增大，呈明顯骨質(zhì)疏松表現(xiàn)；與OVX組比較，E2組和Ts組股骨頭周邊骨皮質(zhì)較厚和骨小梁較均勻密度排列，小梁之間間隙變小，骨細(xì)胞大小正常，骨細(xì)胞與骨陷窩之間沒(méi)有明顯腔隙。疏松病理現(xiàn)象改善明顯。E2組和Ts組鏡下骨組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)相近。見(jiàn)圖1。

2.2 各組ALP含量比較 OVX組2、6、8、12 w ALP含量均顯著高于其他3組(P<0.01)；Sham組、E2組、Ts組ALP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間各組ALP含量比較

與OVX組比較：1)P<0.01；下表同

2.3 各組OPG含量比較 OVX組2、6、8、12 w OPG水平明顯低于其他3組(P<0.01)；Sham組、E2組、Ts組第2、6、8、12 w OPG水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同時(shí)間各組OPG水平比較

2.4 各組RANKL水平比較 OVX組2、6、8、12 w RANKL水平明顯高于同時(shí)期其他3組(P<0.01)；Sham組、Ts組、E2組第2、6、8、12 w RANKL水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間各組RANKL水平比較

3 討 論

OVX組大鼠血清OPG降低，RANKL和ALP升高，且骨切片光鏡可見(jiàn)，骨細(xì)胞萎縮變小，骨細(xì)胞與骨陷窩壁間隙明顯增大，骨質(zhì)疏松的典型表現(xiàn)，說(shuō)明模型制備成功。

通過(guò)摘除SD雌性大鼠卵巢，使其雌激素減少來(lái)源，明顯降低雌激素血液水平，很好模擬絕經(jīng)后老年女性卵巢功能退化導(dǎo)致雌激素減少引起骨質(zhì)疏松。通過(guò)E2干預(yù)后，大鼠股骨頭骨小梁變粗變密，骨小梁與骨小梁之間間隙明顯變小變窄，骨細(xì)胞與骨陷窩壁間隙明顯縮小。骨質(zhì)疏松的病理改變得到明顯好轉(zhuǎn)。通過(guò)E2干預(yù)后，大鼠血清OPG明顯提高，而RANKL和ALP明顯降低。因?yàn)榇萍に赜写龠M(jìn)OPG分泌，促使成骨細(xì)胞提高成骨功能〔3〕，抑制RANKL生成，降低ALP水平，從而抑制破骨細(xì)胞的溶骨作用〔4～7〕。Ts組也有E2組相似作用，也能提高OPG，降低RANKL和ALP,說(shuō)明也有雌激素樣作用，也有提高成骨細(xì)胞形成骨質(zhì)、促進(jìn)骨質(zhì)形成、鈣化作用，抑制破骨細(xì)胞作用〔8～11〕，可以用于PMOP治療。

本研究結(jié)果表明，葛根素可以提高OPG，增加骨量，降低RANKL和ALP，拮抗破骨細(xì)胞功能，從而達(dá)到防治雌激素減少導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，與相關(guān)研究結(jié)果一致〔12～15〕。