古聯(lián) 李敏華 李金鴻 梁寶云 黃思蕓 蘇莉

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科，廣西 南寧 530023；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)；3廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

《金貴要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》說道：“正氣引邪，喎僻不遂。邪在于絡(luò)，肌膚不仁；邪在于經(jīng)，即重不勝，邪入于腑，即不識(shí)人；邪入于臟，舌即難言，口吐涎。”《素問·痹論》有云：“心痹者，脈不通，煩則心下鼓，暴上氣而喘?！敝嗅t(yī)學(xué)對(duì)缺血性腦卒中(IS)及冠心病(CAD)都有詳盡的描述；現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，缺血性心腦血管疾病的發(fā)病與基因遺傳多態(tài)性有關(guān)。F10〔即凝血因子Ⅹ(FⅩ)〕是一種血漿糖蛋白，其活性形式(FⅩa) 在血液凝固的反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。FⅩa可誘導(dǎo)凝血酶的產(chǎn)生，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分裂〔1〕。FⅩ活性增加代表潛在的高凝狀態(tài)，可使動(dòng)脈粥樣硬化血栓并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高〔2〕，而腦梗死、冠心病患者的血液長期處于高凝狀態(tài)〔3〕。因此，F(xiàn)10可能參與了心腦血管疾病中IS及CAD的發(fā)生與發(fā)展過程。本研究旨在探討F10基因多態(tài)性與IS痰瘀證及CAD痰瘀證中凝血標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象

1.1.1 一般資料 IS、CAD病例來源于2015年1月至2017年12月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科及心血管科住院治療的患者。IS痰瘀證550例(男306例、女244例)，平均年齡(70.10±8.82)歲；CAD痰瘀證550例(男316例、女234例)，平均年齡(70.07±10.95)歲。對(duì)照組樣本源于同期在該院健康體檢中心的健康體檢人群及骨科病情輕微的外傷住院病人，且性別、年齡分布均與病例組相匹配。對(duì)照組550例(男293例，女257例)，平均年齡(69.23±9.68)歲。三組間性別、年齡分布上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.050)。納入的1 650例研究對(duì)象均為相互之間無血緣關(guān)系的中國漢族人，并簽署知情同意書。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn) IS的西醫(yī)診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四次全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》；中醫(yī)診斷遵循1996年國家中醫(yī)藥管理局全國腦病急癥科研協(xié)作組制訂的《中風(fēng)病診斷療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(試行)》，所有IS患者均經(jīng)頭顱CT和(或)磁共振成像(MRI)確診。CAD納入的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國際心臟病學(xué)會(huì)和協(xié)會(huì)及WHO臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化專題組聯(lián)合報(bào)告《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》；中醫(yī)診斷采用中國1990年中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)心血管學(xué)會(huì)修訂的《冠心病中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》；納入的CAD患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影、血清心肌酶、心電圖等檢查確診。IS痰瘀證及CAD痰瘀證患者的中醫(yī)辨證分型需滿足“心腦血管病痰證的宏觀辨證標(biāo)準(zhǔn)”〔4〕和第二屆全國活血化瘀研究學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)》〔5〕。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除由動(dòng)脈炎、腫瘤、血液病、腦外傷、腦血管畸形、藥物等引起的腦卒中、嚴(yán)重瓣膜性心臟病、惡性心律失常反復(fù)發(fā)作及紐約心臟病協(xié)會(huì)(NYHA)分級(jí)心功能Ⅳ級(jí)等急危重癥者，及合并嚴(yán)重免疫系統(tǒng)或感染性疾病者，年齡低于40歲或超過80歲者。對(duì)照組中有心腦血管疾病家族史的患者或因精神、語言等因素?zé)o法合作完成資料收集者不納入此次研究。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 用加入乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管采集參與者清晨空腹血2 ml，使用全血基因組DNA提取試劑盒〔北京艾德萊生物科技有限公司(Aidlab biotechnologies CO.Ltd)〕，按照試劑說明書提供的操作步驟提取血液基因組DNA，采用1.25%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)檢，合格即放至-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。通過Agena平臺(tái)，采用MassARRAY SNP基因分型實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)F10基因rs3093261、rs563964多態(tài)性位點(diǎn)的基因分型進(jìn)行檢測(cè)。采用 AssayDesigner3.1 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中位點(diǎn)rs3093261第一引物序列為：ACGTTGGATGCGTTGGCATCCAGCATCATC，第二引物序列為：ACGTTGGATGAGCCTGGTGTGCACACATTG。位點(diǎn)rs563964 第一引物序列為：ACGTTGGATGTGGGAACACATCCACTCT GG，第二引物序列為：ACGTTGGATGAGAACAGAAAGTCCCCACAC。

1.2.2 基因表達(dá)水平檢測(cè) 用EDTA抗凝管采集研究對(duì)象空腹外周靜脈血5 ml，采用TRIzol法，通過TRIzolTMReagent (InvitrogenTM)試劑提取血清總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)及T100TMThermal Cycler(BIO-RAD)對(duì)血清總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。F10基因堿基序列需從NCBI中的GenBank上查找，委托寶生物工程(大連)有限公司完成引物設(shè)計(jì)及合成。以GAPDH為內(nèi)參，上游引物為5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′，下游引物為5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′。目的基因F10，上游引物序列為：5′-GCCAGAACCAGGG CAAATGTA-3′，下游引物序列為：5′-CCGTTGTCAGCCAGGGTGTA-3′。F10基因mRNA表達(dá)水平的測(cè)定通過qRT-PCR技術(shù)，使用Applied Biosystems 7500 Fast型熒光定量PCR儀及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。各F10 mRNA表達(dá)水平比較用相對(duì)表達(dá)量2-△△ct計(jì)算。

1.2.3 凝血標(biāo)志物的測(cè)定 采集研究對(duì)象空腹血2 ml，采用凝固法通過法國StAgO Capact血凝儀檢測(cè)血漿中凝血功能指標(biāo)，包括活化部分凝血酶原時(shí)間(APTT)、D二聚體(D-D)、纖維蛋白原(FIB)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶原時(shí)間活動(dòng)度(PTA)、凝血酶時(shí)間(TT)。采用電阻抗法，通過邁瑞6900全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)全血中血小板(PLT)的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用PLINK對(duì)基因型與表型進(jìn)行遺傳關(guān)聯(lián)分析?；蛐皖l率分布的哈溫平衡(HWE)通過擬和優(yōu)度χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。應(yīng)用非條件Logistic回歸模型對(duì)各遺傳模型(加性模型、顯性模型、隱性模型)與疾病的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，通過比值比(OR)及 95%置信區(qū)間(CI)表示其關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。多態(tài)性位點(diǎn)與數(shù)量性狀的相關(guān)性分析使用一般線性模型。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行其他計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 F10基因mRNA表達(dá)水平比較 IS痰瘀證F10基因mRNA表達(dá)水平(0.855±0.307)顯著高于對(duì)照組(0.249±0.156，P<0.001)；CAD痰瘀證組F10基因mRNA表達(dá)水平(0.735±1.247)亦顯著高于對(duì)照組(0.249±0.156，P=0.003)。

2.2 F10基因多態(tài)性的基因型分布與HWE檢驗(yàn) F10基因多態(tài)性rs3093261(P=0.180)、rs563964(P=1.000)位點(diǎn)的基因型在對(duì)照組中的分布均符合HWE。IS痰瘀證組與對(duì)照組及CAD痰瘀證組與對(duì)照組之間的rs3093261基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.218，P=0.544；χ2=1.173，P=0.556)。rs563964位點(diǎn)的基因型頻率在IS痰瘀證組與對(duì)照組及CAD痰瘀證組與對(duì)照組之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.634，P=0.728；χ2=0.570，P=0.752)。見表1。

2.3 F10基因多態(tài)性與IS痰瘀證、CAD痰瘀證發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析 在各個(gè)遺傳模型中，F(xiàn)10基因rs3093261、rs563964多態(tài)性與IS痰瘀證發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，位點(diǎn)rs3093261、rs563964與CAD痰瘀證發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)亦均未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。見表2。

2.4 F10基因多態(tài)性與IS痰瘀證凝血標(biāo)志物的分析 F10基因rs3093261多態(tài)性與IS痰瘀證組的APTT水平顯著相關(guān) 〔隱性模型：βadj(95%CI)= 1.09(0.74～1.59)，Padj=0.022〕，但位點(diǎn)rs563964與IS痰瘀證患者凝血標(biāo)志物各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。見表3。

2.5 F10基因多態(tài)性與CAD痰瘀證凝血標(biāo)志物的分析 F10基因rs563964多態(tài)性與CAD痰瘀證患者的PLT水平的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(加性模型：βadj(95%CI)= -14.97(-26.68～-3.26)，Padj=0.013；顯性模型：βadj(95%CI)= -16.45(-29.77～-3.13)，Padj=0.016)，而F10基因中rs3093261位點(diǎn)與CAD痰瘀證患者凝血標(biāo)志物相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表4。

表1 三組F10基因rs3093261、rs563964位點(diǎn)基因型頻率分布比較及HWE檢驗(yàn)(n)

A1：小等位基因；A2：大等位基因；PHWE為對(duì)照組的HWE檢驗(yàn)P值；1)有1例基因分型失敗

表2 F10基因rs3093261、rs563964多態(tài)性與IS痰瘀證、CAD痰瘀證發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析

表3 F10基因rs3093261、rs563964多態(tài)性與IS痰瘀證凝血標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)分析

βa：未進(jìn)行校正；βb：根據(jù)年齡、性別進(jìn)行校正；Padj：根據(jù)年齡、性別進(jìn)行校正；下表同

表4 F10基因rs3093261、rs563964多態(tài)性與CAD痰瘀證凝血標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

關(guān)于IS及CAD，在《本草新編》中提到：“中風(fēng)未有不成痰瘀者也?！倍凇蹲C因脈治》中則提到：“心痹之因痰凝血滯?！碧岛宛鲈贗S痰瘀證及CAD痰瘀證中既是病理產(chǎn)物，同時(shí)也作為致病因素存在，痰、瘀二者在一定的條件下可以相互轉(zhuǎn)化、合而致病。楊利等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，瘀血和痰濁在IS的發(fā)病中有著重要作用，且存在于IS發(fā)展的整個(gè)過程?，F(xiàn)代研究〔7〕認(rèn)為，血液中脂質(zhì)沉著為痰濁存在的表現(xiàn)，而微循環(huán)功能障礙中血細(xì)胞的黏附相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)所說的瘀血；痰、瘀的相互結(jié)合可致使血管內(nèi)皮受到損傷，進(jìn)而導(dǎo)致IS和(或)CAD的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果說明F10基因可能同時(shí)影響IS痰瘀證、CAD痰瘀證的發(fā)病機(jī)制。FⅩ作為一種血漿糖蛋白，在凝血級(jí)聯(lián)中起著關(guān)鍵作用，凝血級(jí)聯(lián)是凝血酶形成共同途徑中的第一種酶。組織因子通過與激活FⅩ的激活因子Ⅶ(FⅦa)形成復(fù)合物來啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。FⅩa與其活化的輔因子Ⅴa因子(FⅤa)的結(jié)合導(dǎo)致凝血酶、纖維蛋白形成和血小板生成的激活〔8〕。血小板的活化影響了痰瘀證的發(fā)生發(fā)展過程，高血壓作為IS及CAD的共同危險(xiǎn)因素，高血壓痰瘀證的發(fā)展過程實(shí)際上就是一個(gè)PLT激活程度增強(qiáng)、促進(jìn)聚集和血栓形成的過程〔9〕。F10可能通過激活FⅩa間接影響了IS痰瘀證、CAD痰瘀證的發(fā)生發(fā)展，提示F10基因表達(dá)參與了IS痰瘀證及CAD痰瘀證的臨床病理過程。

本研究發(fā)現(xiàn)F10基因rs3093261多態(tài)性與IS痰瘀證患者的APTT水平顯著相關(guān)，提示F10 基因多態(tài)性可能影響IS痰瘀證患者的凝血功能。潘學(xué)誼等〔10〕認(rèn)為血液黏稠度的增加是導(dǎo)致IS患者腦梗死的重要原因，血液處于高凝狀態(tài)時(shí)，血管內(nèi)血栓形成增加了血管堵塞風(fēng)險(xiǎn)。在凝血途徑中，F(xiàn)Ⅹ既可以被內(nèi)源性凝血途徑FⅨa/FⅧa 激活，又可以被外源性凝血途徑 FⅦa/TF激活，轉(zhuǎn)化為活性形式FⅩa。FⅩa是共同凝血途徑中的關(guān)鍵酶，通過激活凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，從而促進(jìn)凝血酶的生成〔11〕。FⅩa不僅在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而且在許多細(xì)胞類型如內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中通過蛋白酶活化受體發(fā)揮促炎反應(yīng)作用〔12～14〕。APTT的水平在一定程度上反映了內(nèi)源性凝血途徑的狀況，降低則見于高凝狀態(tài)〔15〕。本研究中位點(diǎn)rs3093261多態(tài)性與IS痰瘀證患者的APTT水平有關(guān)提示在臨床上F10 基因多態(tài)性可作為IS痰瘀證APTT水平的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)10基因rs563964多態(tài)性與CAD痰瘀證患者的PLT水平在加性模型、顯性模型中均有顯著相關(guān)性，提示F10基因多態(tài)性可能影響CAD痰瘀證患者的凝血功能。早期研究表明，PLT參數(shù)在血栓性疾病的診斷中具有重要的臨床意義〔16〕，包括PLT在內(nèi)的血液高凝狀態(tài)為心血管疾病的發(fā)生提供了基礎(chǔ)〔17〕。在先前流行病學(xué)研究中，高血漿FⅩ水平是冠狀動(dòng)脈疾病或復(fù)發(fā)性心肌梗死的主要危險(xiǎn)因素，主要與高三酰甘油血癥相關(guān)〔18，19〕。在動(dòng)脈粥樣硬化和CAD的發(fā)生發(fā)展中，血栓的形成發(fā)揮了重要的作用，并與凝血機(jī)制密切相關(guān)〔20〕。凝血酶與PLT受體結(jié)合促進(jìn)PLT釋放血管內(nèi)皮生長因子，還可與單核細(xì)胞受體結(jié)合通過釋放各種炎癥細(xì)胞因子參與組織損傷和血管再生〔21〕。

總之，F(xiàn)10基因表達(dá)水平可能同時(shí)影響IS痰瘀證、CAD痰瘀證的發(fā)生，提示F10基因mRNA表達(dá)可作為IS痰瘀證、CAD痰瘀證的候選治療靶點(diǎn)；另外，F(xiàn)10基因遺傳多態(tài)性可能對(duì)IS痰瘀證、CAD痰瘀證的凝血功能都有影響。