鄒禹　劉園園　張培江　錢(qián)寶云　張煒

摘要：為明確水稻富亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶OsRPK1響應(yīng)外源生長(zhǎng)素的作用機(jī)制，首先分析外源生長(zhǎng)素2，4-D 對(duì)OsRPK1轉(zhuǎn)基因水稻根部表型的影響;其次，異源表達(dá)OsRPK1胞外富亮氨酸重復(fù)LRRs，檢測(cè)H3-IAA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合融合蛋白GST-LRRs后的放射性活度以及利用等溫滴定量熱（ITC）法分析IAA與融合蛋白GST-LRRs相互作用的微熱量變化。結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下，OsRPK1過(guò)表達(dá)能夠抑制水稻側(cè)根的生長(zhǎng);0.01 μmol/L 2，4-D處理 4 d 后發(fā)現(xiàn)，OsRPK1抑制表達(dá)植株側(cè)根的數(shù)量比野生型多112%（P<0.01），而OsRPK1過(guò)表達(dá)植株側(cè)根生長(zhǎng)受到極顯著抑制（P<0.001）;0.1 μmol/L 2，4-D處理10 d后，抑制表達(dá)植株不定根的數(shù)量相對(duì)于野生型多18.2%（P<0.05），而過(guò)表達(dá)植株不定根的生長(zhǎng)受到顯著抑制（P<0.01）;大腸桿菌BL21（DE3）誘導(dǎo)表達(dá)獲得了包涵體形式的GST-LRRs融合蛋白，通過(guò)復(fù)性、純化獲得可溶性融合蛋白;H3-IAA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合融合蛋白GST-LRRs以及IAA溶液滴定融合蛋白的微熱量分析都表明OsRPK1與外源生長(zhǎng)素未發(fā)生直接作用。

關(guān)鍵詞：水稻富亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶OsRPK1;原核表達(dá);外源生長(zhǎng)素;融合蛋白GST-LRRs

中圖分類(lèi)號(hào)：S511.01;Q55文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0046-06

植物類(lèi)受體蛋白激酶（receptor-like protein kinase，RLKs）是一類(lèi)包含胞外結(jié)構(gòu)域（extracellular domain）、單次跨膜域（signle-pass transmembran domain）和胞內(nèi)激酶域（cytoplasmic protein kinase domain）的蛋白分子[1]。在植物中類(lèi)受體蛋白激酶家族非常龐大，擬南芥中至少有610個(gè)成員，水稻中幾乎是擬南芥的2倍，其中胞外富亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶（leucine-rich repeat receptor like protein kinase，LRR-RLKs）是植物類(lèi)受體蛋白激酶家族中數(shù)量最大的亞族，該亞族在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了239個(gè)成員，水稻中有309個(gè)成員，并在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗逆脅迫中發(fā)揮重要作用[2]。在植物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中LRR-RLKs的胞內(nèi)激酶域保守性較高，而胞外LRRs具有特異性，如LRRs基序的數(shù)量、長(zhǎng)度及位置存在差異性，這可能是賦予LRR-RLKs識(shí)別不同胞外信號(hào)或配體，通過(guò)跨膜域?qū)⑿盘?hào)傳遞至胞內(nèi)，引起細(xì)胞的生理生化反應(yīng)。

鑒定LRR-RLKs胞外LRRs識(shí)別的配體對(duì)于充分理解該類(lèi)激酶的生物學(xué)功能具有重要的意義，但目前為止，只有少數(shù)植物L(fēng)RR-RLKs的配體是明確的。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的這些配體包括內(nèi)源或外源的肽類(lèi)和小分子激素，LRR-RLKs通過(guò)胞外LRRs識(shí)別配體，繼而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫等，更好地適應(yīng)體內(nèi)外環(huán)境的變化[3-4]。如水稻受體蛋白激酶基因Xa21是白葉枯病廣譜抗性基因，胞外23個(gè)LRRs識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的病程識(shí)別蛋白，誘導(dǎo)Xa21胞內(nèi)激酶自磷酸化，產(chǎn)生一系列細(xì)胞反應(yīng)，提高水稻對(duì)白葉枯病的抗性[5-6]。油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）受體BRI1（brassinosteroid-insensitive 1）胞外的LRRs能形成島狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對(duì)識(shí)別BR具有重要的作用。BAK1（BRI-associated kinase 1）也是一個(gè)LRR型受體蛋白激酶，膜外含有亮氨酸拉鏈、5個(gè)LRRs和1個(gè)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，大量試驗(yàn)已證明BAK1與BRI1形成異源二聚體，作為BRI1受體伴侶參與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7-9]，所以BR是BRI1的配體。FLS2是植物抗菌免疫至關(guān)重要的LRR-RLKs，胞外含有28個(gè)LRRs能夠識(shí)別配體細(xì)菌鞭毛蛋白（flagellin） N端保守的22個(gè)氨基酸（Flg22），使植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)[10-11]。CLV3是一個(gè)調(diào)控?cái)M南芥莖頂端分生區(qū)發(fā)育的多肽配體，能夠與受體CLV1（胞外富含LRRs的受體蛋白激酶）、CLV2（胞外含有LRRs，但胞內(nèi)不含激酶域）、RPK2（receptor-like protein kinase 2）[12-13]結(jié)合完成信號(hào)傳遞。最近我國(guó)科學(xué)家揭示了一類(lèi)含有磺酸化修飾的13個(gè)氨基酸的小肽激素RGF是根分生組織生長(zhǎng)因子，其受體是5個(gè)位于膜上的LRR-RLKs RGFRs，RGFRs識(shí)別RGF肽激素信號(hào)調(diào)控根干細(xì)胞，維持根的正常生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成以及向重力生長(zhǎng)[14]。為了更廣泛地了解這類(lèi)受體蛋白激酶，尋找這類(lèi)蛋白激酶胞外LRR結(jié)合的配體還有大量工作需要完成。

生長(zhǎng)素是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的植物激素[15]，現(xiàn)研究最多的生長(zhǎng)素受體是運(yùn)輸抑制劑響應(yīng)蛋白（transport inhibitor resisrant 1，TIR1）和生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白（auxin binding protein，ABP1）。1997年Ruegger等發(fā)現(xiàn)了TIR1[16]，隨后被證明確定為生長(zhǎng)素受體蛋白[17-18]，但TIR1主要介導(dǎo)胞內(nèi)的生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。ABP1可能參與胞外的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在過(guò)去幾十年中一直作為候選的生長(zhǎng)素受體受到關(guān)注，最近研究在擬南芥中發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的abp1突變體不顯示任何明顯的發(fā)育缺陷、生長(zhǎng)素相關(guān)的生理反應(yīng)以及影響生長(zhǎng)素相關(guān)的基因表達(dá)，認(rèn)為ABP1并不是擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育和生長(zhǎng)素信號(hào)途徑所必需的[19]，所以識(shí)別外源生長(zhǎng)素的受體至今仍未發(fā)現(xiàn)。LRR-RLKs的胞外LRR基序能夠識(shí)別外源植物激素油菜素內(nèi)酯BR、胞內(nèi)分泌性蛋白或肽類(lèi)激素等，從而參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性。本研究前期利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從水稻根部鑒定出一個(gè)新的具有激酶活性的富亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶OsRPK1，主要受外源生長(zhǎng)素2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）和IAA（吲哚乙酸）誘導(dǎo)表達(dá)，并且OsRPK1能影響部分生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸相關(guān)基因[20]和部分生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)（數(shù)據(jù)未發(fā)布），而不影響生長(zhǎng)素合成重要基因OsYUCCA1表達(dá)。為了進(jìn)一步闡明OsRPK1參與外源生長(zhǎng)素的作用機(jī)制，首先利用OsRPK1過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻觀察對(duì)外源生長(zhǎng)素敏感性以及側(cè)根、不定根生長(zhǎng)的影響;其次異源表達(dá)OsRPK1胞外LRRs，在體外分析OsRPK1的LRRs是否識(shí)別及結(jié)合生長(zhǎng)素，為進(jìn)一步研究OsRPK1的可能配體以及參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，原核表達(dá)載體pGEX-4T-1為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自大連TaKaRa公司，T4 DNA聚合酶購(gòu)自新英格蘭（NEB）公司，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，蛋白Marker購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，GST結(jié)合樹(shù)脂購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司，2，4-D、IAA購(gòu)自Sigma公司，H3-IAA購(gòu)自American Radiolabeled Chemicals公司。

日本晴（Oryza.Sativa L.spp.japonica cv.Nipponbare）水稻種子及T3代OsRPK1過(guò)表達(dá)株系O1、O7與抑制表達(dá)株系A(chǔ)5、A7種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。觀察OsRPK1[STBZ]轉(zhuǎn)基因植株與日本晴在外源生長(zhǎng)素2，4-D處理下的側(cè)根和不定根的表型參照文獻(xiàn)[21-23]，并稍有改動(dòng)。選取籽粒飽滿(mǎn)的日本晴和轉(zhuǎn)基因水稻種子，除去稻殼、表面消毒殺菌后移入1/2 MS固體培養(yǎng)基中，待萌發(fā)后再分別移至含有0、0.01、0.10 μmol/L 2，4-D的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，28 ℃ 光照培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)4、10 d，其中光照度為 600 μmol/（m2·s），光照條件為白天14 h和黑夜10 h，相對(duì)濕度為75%，對(duì)水稻側(cè)根、不定根進(jìn)行觀察、拍照以及統(tǒng)計(jì)，采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以***（P<0.001）、**（P<0.01）、*（P<0.05）表示不同程度的差異顯著性。

1.2融合表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)在線(xiàn)網(wǎng)站SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析水稻類(lèi)受體蛋白激酶OsRPK1（NCBI登錄號(hào)：XP_015640180）的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，確定胞外富亮氨酸重復(fù)序列LRRs的位置并設(shè)計(jì)2條引物用于擴(kuò)增該區(qū)域：上游引物 P1-LRR-F：TAA[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]CAGACCAACGCCCAGGACG（劃線(xiàn)為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物P1-LRR-R：TAA[ZZ（Z]GCGGCC[ZZ）]GCGCCACCAAGAGCAACTGCCAAG（劃線(xiàn)為NotⅠ酶切位點(diǎn)），引物由上海英駿生物有限公司合成。水稻根部總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA參照TaKaRa產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，利用高保真PrimeSTAR GXL DNA聚合酶以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)擴(kuò)增35次;72 ℃ 充分延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后將目的片段回收、純化，目的片段與pGEX-4T-1空載體分別用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后用T4 DNA連接酶于16 ℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和測(cè)序驗(yàn)證。

1.3富亮氨酸重復(fù)序列LRRs體外原核表達(dá)

將構(gòu)建成功的pGEX-LRRs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽(yáng)性克隆并接種于5 mL LB（含有 50 μg/mL 卡那霉素）新鮮液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm=0.8，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，搖床振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h;吸取1 mL菌液，12 000 r/min離心5 min后棄上清，加入80 mL磷酸緩沖液重懸后，再加入20 μL 5倍上樣緩沖液混勻，沸水中處理5 min使蛋白變性。12 000 r/min 離心10 min后取上清液于12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定。

1.4包涵體的復(fù)性和純化

將活化的含有pGEX-LRRs質(zhì)粒的BL21（DE3）表達(dá)菌株按1 ∶100接種于1 L LB新鮮液體培養(yǎng)基中（含有 50 μg/mL 卡那霉素），37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm= 0.8，加入0.8 mmol/L IPTG后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，12 000 r/min離心5 min收集菌體;棄上清液，加入50 mL緩沖液（含有 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH值為8.5）重懸菌體，用超聲裂解法破碎大腸桿菌，12 000 r/min離心15 min收集沉淀;用含有1% TritonX-100和2 mol/L尿素的緩沖液洗滌沉淀3次后，12 000 r/min離心15 min收集包涵體沉淀，用含有8 mol/L尿素和1 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的緩沖液充分溶解包涵體沉淀，溫室放置1 h，12 000 r/min離心15 min收集上清液;將上清液緩緩加入含有0.4 mol/L L-精氨酸和2 mmol/L DTT的緩沖液中，不斷攪拌溶液直至沉淀溶解，4 ℃靜置過(guò)夜，使得變性蛋白能夠完全復(fù)性;12 000 r/min離心15 min，收集上清液。上清液裝入透析袋中，利用磷酸緩沖液透析過(guò)夜去除復(fù)性液中的變性劑;復(fù)性后的蛋白液利用Sephacryl-S200柱純化，凍干濃縮存于-80 ℃冰箱中待用。

1.5融合蛋白GST-LRRs與外源生長(zhǎng)素體外結(jié)合試驗(yàn)

吸取200 μL GST結(jié)合樹(shù)脂于1.5 mL離心管中，磷酸緩沖液清洗6次后吸取10 μg GST-LRRs融合蛋白至GST結(jié)合樹(shù)脂中，輕輕混勻，溫室孵育3 h;磷酸緩沖液再清洗6次，除去未結(jié)合的融合蛋白;加入100 nmol/L H3-IAA于4組含有融合蛋白的GST樹(shù)脂中，每組再依次加入0、0.1、1.0、10.0 μmol/L IAA，每組3次重復(fù);用磷酸緩沖液補(bǔ)至體積為 1 mL，置于室溫孵育30 min;300 r/min離心1 min后，輕輕倒除磷酸緩沖液，用磷酸緩沖液清洗3次;加入100 μL ddH2O重懸GST結(jié)合樹(shù)脂后倒入5 mL離心管中，并用3 mL閃爍液沖洗GST結(jié)合樹(shù)脂，收集GST結(jié)合樹(shù)脂于5 mL離心管;避光置于溫室1 h后用Beckman液閃儀讀數(shù)。

1.6等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）測(cè)定GST-LRRs和外源生長(zhǎng)素相互作用

等溫滴定量熱試驗(yàn)采用MicroCal公司的VP-ITC進(jìn)行測(cè)定，數(shù)據(jù)處理利用Origin 7.0軟件，參照文獻(xiàn)[24]。將 1 mL 5 μmol/L GST-LRRs融合蛋白注入至樣品池中，微量滴定注射器吸取100 μL IAA溶液，以上溶液皆用pH值5.5磷酸緩沖液稀釋配制;以1 mL pH值5.5磷酸緩沖液做參比，并注入?yún)⒄粘刂?。設(shè)置反應(yīng)溫度為20 ℃，將IAA溶液滴定到GST-LRRs融合蛋白溶液中，每次滴加10 μL，滴加次數(shù)共20次，平衡時(shí)間200 s，間隔300 s，攪拌速度為500 r/min。

2結(jié)果與分析

2.1外源生長(zhǎng)素2，4-D處理后的OsRPK1轉(zhuǎn)基因水稻根部表型分析

水稻萌發(fā)后移至1/2 MS固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4 d后，OsRPK1抑制表達(dá)植株AX（表示A5、A7）與野生型側(cè)根數(shù)量無(wú)顯著差異（P>0.05），而OsRPK1過(guò)表達(dá)植株OX（表示O1、O7）的側(cè)根數(shù)量相對(duì)于野生型顯著減少（P<0.01）（圖1-A）;生長(zhǎng)10 d后，OsRPK1過(guò)表達(dá)植株OX、OsRPK1抑制表達(dá)植株AX和野生型的不定根數(shù)量基本一致（圖2-A）。進(jìn)一步觀察0.01 μmol/L 2，4-D處理4 d以后的側(cè)根變化，OsRPK1抑制表達(dá)植株AX側(cè)根的數(shù)量比野生型多112%（P<0.01）（圖1-B），而OsRPK1過(guò)表達(dá)植株OX側(cè)根的發(fā)生受到顯著抑制（P<0.001）（圖1-C）。0.1 μmol/L 2，4-D 處理10 d以后，抑制表達(dá)植株AX的不定根數(shù)量相對(duì)于野生型WT多18.2%，差異顯著（P<0.05）（圖2-C），而過(guò)表達(dá)植株OX的不定根發(fā)生受到顯著抑制，與野生型相比差異極顯著（P<0.01）（圖2-C）。以上結(jié)果表明，在水稻中OsRPK1表達(dá)量的改變能影響水稻側(cè)根的發(fā)生，外源生長(zhǎng)素2，4-D處理情況下，OsRPK1[STBZ]負(fù)調(diào)控水稻側(cè)根和不定根的發(fā)生，這暗示了OsRPK1[STBZ]可能參與生長(zhǎng)素生理反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)水稻根部的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.2原核表達(dá)載體pGEX-LRRs的構(gòu)建

設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增OsRPK1胞外富亮氨酸重復(fù)序列LRRs，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后顯示大小為 1 600 bp 左右，與預(yù)期值1598 bp相符（圖3-A）?；厥漳康钠魏驮吮磉_(dá)載體pGEX-4T-1，分別用NotⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，T4連接酶連接后構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-LRRs，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌株，篩選陽(yáng)性單克隆后提取質(zhì)粒進(jìn)行 NotⅠ 和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物是1 600 bp左右的LRRs片段和pGEX-4T-1線(xiàn)性化載體，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物大小與理論值相符（圖3-B）。陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列一致，無(wú)堿基突變或缺失，說(shuō)明pGEX-LRRs原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3富亮氨酸重復(fù)序列LRRs體外原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-LRRs轉(zhuǎn)化BL21（DE3）菌株感受態(tài)，嘗試在不同溫度、不同濃度IPTG條件下誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，選定37 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h作為蛋白表達(dá)條件，表達(dá)得到的蛋白通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)（圖4），第1泳道為未加IPTG誘導(dǎo)的陰性對(duì)照，2泳道為加0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)蛋白，且蛋白大小與目的蛋白大?。?1.7 ku）相吻合，說(shuō)明融合蛋白GST-LRRs在BL21（DE3）表達(dá)菌株中成功表達(dá)。進(jìn)一步分析，如圖5所示，1泳道為IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后菌液經(jīng)離心收集的上清液，上清液里未檢測(cè)到融合蛋白，說(shuō)明GST-LRRs融合蛋白在大腸桿菌中以不溶性的、無(wú)活性的包涵體形式存在。為了得到有活性的可溶性融合蛋白，首先對(duì)其進(jìn)行變性溶解，然后再將其復(fù)性，4泳道是復(fù)性后獲得的高純度的GST-LRRs融合蛋白，此蛋白可以滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.4融合蛋白GST-LRRs與外源生長(zhǎng)素相互作用分析

利用100 nmol/L H3-IAA和0、0.1、1.0、10.0 μmol/L不同濃度的IAA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合10 μg融合蛋白GST-LRRs，用磷酸緩沖液洗脫未被結(jié)合的H3-IAA和IAA，Beckman液閃儀讀取與融合蛋白結(jié)合的H3-IAA放射性活度。結(jié)果如圖6所示，只有100 nmol/L H3-IAA時(shí)，和GST-LRRs結(jié)合后，放射性活度測(cè)得為918.6 d.p.m，隨著未被同位素標(biāo)記的IAA濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L） 的遞增與100 nmol/L H3-IAA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合GST-LRRs，放射性活度分別測(cè)得為870.5、840.3、1 027.6 d.p.m，IAA競(jìng)爭(zhēng)H3-IAA結(jié)合融合GST-LRRs后放射性活度無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明IAA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 GST-LRRs也未改變GST-LRRs與H3-IAA的結(jié)合量，這些結(jié)果表明融合蛋白GST-LRRs未與生長(zhǎng)素發(fā)生直接結(jié)合。

等溫滴定量熱ITC法通過(guò)類(lèi)似化學(xué)滴定的方法，分析2個(gè)物質(zhì)之間相互作用的微熱量變化以研究分子相互作用，廣泛用于檢測(cè)蛋白質(zhì)與小分子相互作用[25-27]。圖7-A顯示的是連續(xù)等溫線(xiàn)5 μmol/L IAA溶液滴定至100 μmol/L GST-LRRs融合蛋白溶液后的補(bǔ)償功率變化。使用數(shù)據(jù)分析軟件Origin 7.0對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行積分和標(biāo)準(zhǔn)化處理，如圖 7-B 所示，得到反應(yīng)熱隨摩爾比的變化函數(shù)圖呈散點(diǎn)狀，說(shuō)明IAA不能結(jié)合GST-LRRs融合蛋白。ITC法得到理想的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，需要反應(yīng)的親和常數(shù)K值在103～108，而IAA和GST-LRRs可能是由于兩者的親和常數(shù)太低，熱量未被儀器檢測(cè)到，從而得不到兩者相互作用的信息。

3結(jié)論與討論

植物在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段會(huì)受到外界環(huán)境脅迫和體內(nèi)細(xì)胞間信號(hào)的影響，LRR-RLKs的胞外LRR結(jié)構(gòu)域能夠首先識(shí)別和接受來(lái)自胞外的信號(hào)，通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)庑盘?hào)傳遞至胞內(nèi)，引起細(xì)胞的生理生化反應(yīng)。OsRPK1在前期被鑒定為一個(gè)新的具有激酶活性、定位于細(xì)胞膜的典型的 LRR-RLK，并且分析OsRPK1在植物激素處理下的表達(dá)模式表明，OsRPK1主要受生長(zhǎng)素2，4-D和IAA誘導(dǎo)表達(dá)，并且 2，4-D誘導(dǎo)效果要比IAA稍顯著[20]。生長(zhǎng)素是調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的一類(lèi)重要的植物激素，在植物根部發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28-29]。為了進(jìn)一步研究OsRPK1與生長(zhǎng)素的相關(guān)性，鑒于2，4-D誘導(dǎo)OsRPK1表達(dá)的效果比IAA稍顯著，并且2，4-D 化學(xué)性質(zhì)也比IAA穩(wěn)定，所以本研究選用2，4-D作為外源生長(zhǎng)素，觀察外源生長(zhǎng)素對(duì)OsRPK1表達(dá)量改變后水稻根部表型的影響。

水稻根系主要由大量的不定根及側(cè)根組成。外源生長(zhǎng)素可促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生，但濃度過(guò)高則抑制側(cè)根原基的露出，Zhang等研究2，4-D對(duì)水稻側(cè)根長(zhǎng)度的影響，利用不同濃度的2，4-D處理野生型和OsWRKY31過(guò)表達(dá)水稻，發(fā)現(xiàn) 0.01 μmol/L 的 2，4-D 處理萌發(fā)后水稻側(cè)根的發(fā)生在6 d時(shí)表型顯著[21];Inukai等研究crl1突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.01～0.10 μmol/L 的2，4-D對(duì)突變體側(cè)根的發(fā)生影響顯著[22]。因此，本研究結(jié)合前人研究結(jié)果選擇0.01 μmol/L的2，4-D作為觀察側(cè)根發(fā)生的作用濃度，結(jié)果表明0.01 μmol/L的2，4-D 處理4 d后，轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)根數(shù)量相對(duì)于野生型差異顯著。正常生長(zhǎng)情況下，OsRPK1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)于野生型的側(cè)根生長(zhǎng)受到顯著抑制（P<0.01），在0.01 μmol/L 2，4-D處理4 d后的OsRPK1抑制表達(dá)植株側(cè)根的數(shù)量與野生型相比多112%（P<0.01），而OsRPK1過(guò)表達(dá)植株側(cè)根生長(zhǎng)受到極顯著抑制（P<0.001）。Wang等研究OsCAND1[STBZ]對(duì)水稻不定根發(fā)生的影響，認(rèn)為0.1 μmol/L 2，4-D處理7 d的水稻Oscand1[STBZ]突變體與野生型不定根的數(shù)量差異最為顯著[23]。本研究利用0.1 μmol/L 2，4-D處理水稻，發(fā)現(xiàn)10 d時(shí)水稻不定根差異明顯，抑制表達(dá)植株不定根的數(shù)量相對(duì)于野生型多18.2%（P<0.05），而過(guò)表達(dá)植株不定根的生長(zhǎng)受到極顯著抑制（P<0.01）。這些表型和已報(bào)道的一些生長(zhǎng)素相關(guān)的突變體表型極為相似，如生長(zhǎng)素上調(diào)小RNA基因SAUR39負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，過(guò)表達(dá)SAUR39轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出側(cè)根的發(fā)生受到抑制[30];OsAGAP（ARF-GTP酶激活蛋白）能夠調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素內(nèi)流和根部發(fā)育，OsAGAP會(huì)破壞水稻中生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，影響主根和側(cè)根的發(fā)育，OsAGAP過(guò)表達(dá)水稻幼苗側(cè)根發(fā)生比野生型水稻慢約2 d，OsAGAP轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在萌發(fā)后12 d的側(cè)根數(shù)約為野生型的50%，不定根的數(shù)量也明顯增多[31];在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Aux/IAA 發(fā)揮著非常重要的作用，Kitomi等研究也表明，Osiaa13突變體的側(cè)根數(shù)量受到明顯的抑制[32]。OsRPK1能影響部分生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸相關(guān)基因[20]和部分生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)。這些結(jié)果表明，OsRPK1可能參與了生長(zhǎng)素信號(hào)途徑或極性運(yùn)輸途徑調(diào)節(jié)水稻根部的生長(zhǎng)發(fā)育。

大量研究已表明生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑響應(yīng)蛋白（TIR1）是生長(zhǎng)素胞內(nèi)受體蛋白[17-18]，介導(dǎo)胞內(nèi)的生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但識(shí)別外源生長(zhǎng)素的受體至今仍未發(fā)現(xiàn)。OsRPK1作為一個(gè)典型的LRR-RLK，其胞外富亮氨酸重復(fù)LRRs可能與外源生長(zhǎng)素相互作用，胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域通過(guò)磷酸化作用將信號(hào)傳遞給下游生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白，從而調(diào)節(jié)水稻側(cè)根和不定根的生長(zhǎng)。因此本研究將OsRPK1蛋白的LRRs通過(guò)原核系統(tǒng)異源表達(dá)，在體外觀察OsRPK1的LRRs結(jié)構(gòu)域是否與生長(zhǎng)素結(jié)合。同位素H3標(biāo)記的IAA與未被同位素標(biāo)記的IAA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)可以判斷一個(gè)蛋白是否與生長(zhǎng)素結(jié)合[17-18]，同時(shí)利用等溫滴定微量熱（ITC）法測(cè)定兩者在體外作用的微熱量變化，試驗(yàn)結(jié)果都表明GST-LRRs并未與外源生長(zhǎng)素結(jié)合。

現(xiàn)有的研究表明LRR-RLKs受體激活的機(jī)制主要有2類(lèi)：一類(lèi)以油菜素內(nèi)酯受體BRI1和鞭毛蛋白受體FLS2為代表，通過(guò)配體的“膠聯(lián)”作用結(jié)合共受體形成異源二聚體來(lái)激活受體[7-11];另一類(lèi)是以植物磺化肽激素受體PSKR為代表，主要通過(guò)配體別構(gòu)誘導(dǎo)受體構(gòu)象變化來(lái)介導(dǎo)受體與其共受體SERK相互作用激活受體[14，33]。在這2種不同的受體激活模式中，涉及的受體和共受體均是LRR型類(lèi)受體蛋白激酶。更有趣的是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的共受體幾乎都是SERK蛋白，一個(gè)共受體如何促進(jìn)不同配體的特異性結(jié)合和激活不同的LRR型受體蛋白激酶尚不清楚[34]。最近科學(xué)家在擬南芥中使用高敏感、高通量相互作用分析法，研究了4萬(wàn)個(gè)潛在的細(xì)胞表面受體胞外結(jié)構(gòu)域的相互作用，構(gòu)建了由567個(gè)相互作用組成的LRR的細(xì)胞表面相互作用網(wǎng)絡(luò)[35]。由此可見(jiàn)，LRR-RLKs在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中功能行使的機(jī)制是多樣化的，且不同的LRR-RLKs在配體識(shí)別過(guò)程中扮演的角色也有區(qū)別，有的LRR-RLKs直接與配體結(jié)合，有的只是作為共受體與受體結(jié)合來(lái)幫助受體識(shí)別配體。雖然在體外試驗(yàn)中未證明融合蛋白GST-LRRs與外源生長(zhǎng)素直接結(jié)合，一方面可能是因?yàn)樵吮磉_(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)，缺乏蛋白翻譯后加工修飾，可能導(dǎo)致表達(dá)的蛋白沒(méi)有生物學(xué)活性，體外試驗(yàn)不能夠完全模擬體內(nèi)環(huán)境。另一方面可能是OsRPK1作為復(fù)雜的細(xì)胞表面互作網(wǎng)絡(luò)的一員，發(fā)揮作用需要結(jié)合其他蛋白或復(fù)合物才能和外源生長(zhǎng)素直接或間接作用，這也將是以后研究OsRPK1參與生長(zhǎng)素信號(hào)途徑和極性運(yùn)輸途徑需要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。

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