鄒禹　劉園園　張培江　錢寶云　張煒

摘要：為明確水稻富亮氨酸重復類受體蛋白激酶OsRPK1響應外源生長素的作用機制，首先分析外源生長素2，4-D 對OsRPK1轉(zhuǎn)基因水稻根部表型的影響;其次，異源表達OsRPK1胞外富亮氨酸重復LRRs，檢測H3-IAA競爭結(jié)合融合蛋白GST-LRRs后的放射性活度以及利用等溫滴定量熱（ITC）法分析IAA與融合蛋白GST-LRRs相互作用的微熱量變化。結(jié)果表明，在正常生長條件下，OsRPK1過表達能夠抑制水稻側(cè)根的生長;0.01 μmol/L 2，4-D處理 4 d 后發(fā)現(xiàn)，OsRPK1抑制表達植株側(cè)根的數(shù)量比野生型多112%（P<0.01），而OsRPK1過表達植株側(cè)根生長受到極顯著抑制（P<0.001）;0.1 μmol/L 2，4-D處理10 d后，抑制表達植株不定根的數(shù)量相對于野生型多18.2%（P<0.05），而過表達植株不定根的生長受到顯著抑制（P<0.01）;大腸桿菌BL21（DE3）誘導表達獲得了包涵體形式的GST-LRRs融合蛋白，通過復性、純化獲得可溶性融合蛋白;H3-IAA競爭結(jié)合融合蛋白GST-LRRs以及IAA溶液滴定融合蛋白的微熱量分析都表明OsRPK1與外源生長素未發(fā)生直接作用。

關鍵詞：水稻富亮氨酸重復類受體蛋白激酶OsRPK1;原核表達;外源生長素;融合蛋白GST-LRRs

中圖分類號：S511.01;Q55文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0046-06

植物類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinase，RLKs）是一類包含胞外結(jié)構(gòu)域（extracellular domain）、單次跨膜域（signle-pass transmembran domain）和胞內(nèi)激酶域（cytoplasmic protein kinase domain）的蛋白分子[1]。在植物中類受體蛋白激酶家族非常龐大，擬南芥中至少有610個成員，水稻中幾乎是擬南芥的2倍，其中胞外富亮氨酸重復類受體蛋白激酶（leucine-rich repeat receptor like protein kinase，LRR-RLKs）是植物類受體蛋白激酶家族中數(shù)量最大的亞族，該亞族在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了239個成員，水稻中有309個成員，并在植物生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導以及抗逆脅迫中發(fā)揮重要作用[2]。在植物長期進化過程中LRR-RLKs的胞內(nèi)激酶域保守性較高，而胞外LRRs具有特異性，如LRRs基序的數(shù)量、長度及位置存在差異性，這可能是賦予LRR-RLKs識別不同胞外信號或配體，通過跨膜域?qū)⑿盘杺鬟f至胞內(nèi)，引起細胞的生理生化反應。

鑒定LRR-RLKs胞外LRRs識別的配體對于充分理解該類激酶的生物學功能具有重要的意義，但目前為止，只有少數(shù)植物LRR-RLKs的配體是明確的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的這些配體包括內(nèi)源或外源的肽類和小分子激素，LRR-RLKs通過胞外LRRs識別配體，繼而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、免疫等，更好地適應體內(nèi)外環(huán)境的變化[3-4]。如水稻受體蛋白激酶基因Xa21是白葉枯病廣譜抗性基因，胞外23個LRRs識別病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）的病程識別蛋白，誘導Xa21胞內(nèi)激酶自磷酸化，產(chǎn)生一系列細胞反應，提高水稻對白葉枯病的抗性[5-6]。油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）受體BRI1（brassinosteroid-insensitive 1）胞外的LRRs能形成島狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對識別BR具有重要的作用。BAK1（BRI-associated kinase 1）也是一個LRR型受體蛋白激酶，膜外含有亮氨酸拉鏈、5個LRRs和1個富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，大量試驗已證明BAK1與BRI1形成異源二聚體，作為BRI1受體伴侶參與BR信號轉(zhuǎn)導[7-9]，所以BR是BRI1的配體。FLS2是植物抗菌免疫至關重要的LRR-RLKs，胞外含有28個LRRs能夠識別配體細菌鞭毛蛋白（flagellin） N端保守的22個氨基酸（Flg22），使植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應[10-11]。CLV3是一個調(diào)控擬南芥莖頂端分生區(qū)發(fā)育的多肽配體，能夠與受體CLV1（胞外富含LRRs的受體蛋白激酶）、CLV2（胞外含有LRRs，但胞內(nèi)不含激酶域）、RPK2（receptor-like protein kinase 2）[12-13]結(jié)合完成信號傳遞。最近我國科學家揭示了一類含有磺酸化修飾的13個氨基酸的小肽激素RGF是根分生組織生長因子，其受體是5個位于膜上的LRR-RLKs RGFRs，RGFRs識別RGF肽激素信號調(diào)控根干細胞，維持根的正常生長發(fā)育、形態(tài)建成以及向重力生長[14]。為了更廣泛地了解這類受體蛋白激酶，尋找這類蛋白激酶胞外LRR結(jié)合的配體還有大量工作需要完成。

生長素是調(diào)控植物生長發(fā)育重要的植物激素[15]，現(xiàn)研究最多的生長素受體是運輸抑制劑響應蛋白（transport inhibitor resisrant 1，TIR1）和生長素結(jié)合蛋白（auxin binding protein，ABP1）。1997年Ruegger等發(fā)現(xiàn)了TIR1[16]，隨后被證明確定為生長素受體蛋白[17-18]，但TIR1主要介導胞內(nèi)的生長素信號轉(zhuǎn)導。ABP1可能參與胞外的細胞信號轉(zhuǎn)導，在過去幾十年中一直作為候選的生長素受體受到關注，最近研究在擬南芥中發(fā)現(xiàn)2個新的abp1突變體不顯示任何明顯的發(fā)育缺陷、生長素相關的生理反應以及影響生長素相關的基因表達，認為ABP1并不是擬南芥生長發(fā)育和生長素信號途徑所必需的[19]，所以識別外源生長素的受體至今仍未發(fā)現(xiàn)。LRR-RLKs的胞外LRR基序能夠識別外源植物激素油菜素內(nèi)酯BR、胞內(nèi)分泌性蛋白或肽類激素等，從而參與植物的生長發(fā)育和抗逆性。本研究前期利用蛋白質(zhì)組學方法從水稻根部鑒定出一個新的具有激酶活性的富亮氨酸重復類受體蛋白激酶OsRPK1，主要受外源生長素2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）和IAA（吲哚乙酸）誘導表達，并且OsRPK1能影響部分生長素極性運輸相關基因[20]和部分生長素信號轉(zhuǎn)導途徑基因表達（數(shù)據(jù)未發(fā)布），而不影響生長素合成重要基因OsYUCCA1表達。為了進一步闡明OsRPK1參與外源生長素的作用機制，首先利用OsRPK1過表達與抑制表達轉(zhuǎn)基因水稻觀察對外源生長素敏感性以及側(cè)根、不定根生長的影響;其次異源表達OsRPK1胞外LRRs，在體外分析OsRPK1的LRRs是否識別及結(jié)合生長素，為進一步研究OsRPK1的可能配體以及參與的信號轉(zhuǎn)導機制提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，原核表達載體pGEX-4T-1為筆者所在實驗室保存。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購自大連TaKaRa公司，T4 DNA聚合酶購自新英格蘭（NEB）公司，異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）購自賽默飛世爾科技公司，蛋白Marker購自北京百泰克生物技術有限公司，GST結(jié)合樹脂購自金斯瑞生物科技有限公司，2，4-D、IAA購自Sigma公司，H3-IAA購自American Radiolabeled Chemicals公司。

日本晴（Oryza.Sativa L.spp.japonica cv.Nipponbare）水稻種子及T3代OsRPK1過表達株系O1、O7與抑制表達株系A5、A7種子由南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院實驗室保存。觀察OsRPK1[STBZ]轉(zhuǎn)基因植株與日本晴在外源生長素2，4-D處理下的側(cè)根和不定根的表型參照文獻[21-23]，并稍有改動。選取籽粒飽滿的日本晴和轉(zhuǎn)基因水稻種子，除去稻殼、表面消毒殺菌后移入1/2 MS固體培養(yǎng)基中，待萌發(fā)后再分別移至含有0、0.01、0.10 μmol/L 2，4-D的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，28 ℃ 光照培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)4、10 d，其中光照度為 600 μmol/（m2·s），光照條件為白天14 h和黑夜10 h，相對濕度為75%，對水稻側(cè)根、不定根進行觀察、拍照以及統(tǒng)計，采用GraphPad Prism6.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，以***（P<0.001）、**（P<0.01）、*（P<0.05）表示不同程度的差異顯著性。

1.2融合表達載體的構(gòu)建

根據(jù)在線網(wǎng)站SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析水稻類受體蛋白激酶OsRPK1（NCBI登錄號：XP_015640180）的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，確定胞外富亮氨酸重復序列LRRs的位置并設計2條引物用于擴增該區(qū)域：上游引物 P1-LRR-F：TAA[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]CAGACCAACGCCCAGGACG（劃線為BamHⅠ酶切位點），下游引物P1-LRR-R：TAA[ZZ（Z]GCGGCC[ZZ）]GCGCCACCAAGAGCAACTGCCAAG（劃線為NotⅠ酶切位點），引物由上海英駿生物有限公司合成。水稻根部總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA參照TaKaRa產(chǎn)品說明書，利用高保真PrimeSTAR GXL DNA聚合酶以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)擴增35次;72 ℃ 充分延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后將目的片段回收、純化，目的片段與pGEX-4T-1空載體分別用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后用T4 DNA連接酶于16 ℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落進行PCR擴增、酶切和測序驗證。

1.3富亮氨酸重復序列LRRs體外原核表達

將構(gòu)建成功的pGEX-LRRs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細胞，PCR鑒定陽性克隆并接種于5 mL LB（含有 50 μg/mL 卡那霉素）新鮮液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm=0.8，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，搖床振蕩誘導培養(yǎng)4 h;吸取1 mL菌液，12 000 r/min離心5 min后棄上清，加入80 mL磷酸緩沖液重懸后，再加入20 μL 5倍上樣緩沖液混勻，沸水中處理5 min使蛋白變性。12 000 r/min 離心10 min后取上清液于12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定。

1.4包涵體的復性和純化

將活化的含有pGEX-LRRs質(zhì)粒的BL21（DE3）表達菌株按1 ∶100接種于1 L LB新鮮液體培養(yǎng)基中（含有 50 μg/mL 卡那霉素），37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm= 0.8，加入0.8 mmol/L IPTG后繼續(xù)誘導培養(yǎng)4 h，12 000 r/min離心5 min收集菌體;棄上清液，加入50 mL緩沖液（含有 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH值為8.5）重懸菌體，用超聲裂解法破碎大腸桿菌，12 000 r/min離心15 min收集沉淀;用含有1% TritonX-100和2 mol/L尿素的緩沖液洗滌沉淀3次后，12 000 r/min離心15 min收集包涵體沉淀，用含有8 mol/L尿素和1 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的緩沖液充分溶解包涵體沉淀，溫室放置1 h，12 000 r/min離心15 min收集上清液;將上清液緩緩加入含有0.4 mol/L L-精氨酸和2 mmol/L DTT的緩沖液中，不斷攪拌溶液直至沉淀溶解，4 ℃靜置過夜，使得變性蛋白能夠完全復性;12 000 r/min離心15 min，收集上清液。上清液裝入透析袋中，利用磷酸緩沖液透析過夜去除復性液中的變性劑;復性后的蛋白液利用Sephacryl-S200柱純化，凍干濃縮存于-80 ℃冰箱中待用。

1.5融合蛋白GST-LRRs與外源生長素體外結(jié)合試驗

吸取200 μL GST結(jié)合樹脂于1.5 mL離心管中，磷酸緩沖液清洗6次后吸取10 μg GST-LRRs融合蛋白至GST結(jié)合樹脂中，輕輕混勻，溫室孵育3 h;磷酸緩沖液再清洗6次，除去未結(jié)合的融合蛋白;加入100 nmol/L H3-IAA于4組含有融合蛋白的GST樹脂中，每組再依次加入0、0.1、1.0、10.0 μmol/L IAA，每組3次重復;用磷酸緩沖液補至體積為 1 mL，置于室溫孵育30 min;300 r/min離心1 min后，輕輕倒除磷酸緩沖液，用磷酸緩沖液清洗3次;加入100 μL ddH2O重懸GST結(jié)合樹脂后倒入5 mL離心管中，并用3 mL閃爍液沖洗GST結(jié)合樹脂，收集GST結(jié)合樹脂于5 mL離心管;避光置于溫室1 h后用Beckman液閃儀讀數(shù)。

1.6等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）測定GST-LRRs和外源生長素相互作用

等溫滴定量熱試驗采用MicroCal公司的VP-ITC進行測定，數(shù)據(jù)處理利用Origin 7.0軟件，參照文獻[24]。將 1 mL 5 μmol/L GST-LRRs融合蛋白注入至樣品池中，微量滴定注射器吸取100 μL IAA溶液，以上溶液皆用pH值5.5磷酸緩沖液稀釋配制;以1 mL pH值5.5磷酸緩沖液做參比，并注入?yún)⒄粘刂?。設置反應溫度為20 ℃，將IAA溶液滴定到GST-LRRs融合蛋白溶液中，每次滴加10 μL，滴加次數(shù)共20次，平衡時間200 s，間隔300 s，攪拌速度為500 r/min。

2結(jié)果與分析

2.1外源生長素2，4-D處理后的OsRPK1轉(zhuǎn)基因水稻根部表型分析

水稻萌發(fā)后移至1/2 MS固體培養(yǎng)基中生長4 d后，OsRPK1抑制表達植株AX（表示A5、A7）與野生型側(cè)根數(shù)量無顯著差異（P>0.05），而OsRPK1過表達植株OX（表示O1、O7）的側(cè)根數(shù)量相對于野生型顯著減少（P<0.01）（圖1-A）;生長10 d后，OsRPK1過表達植株OX、OsRPK1抑制表達植株AX和野生型的不定根數(shù)量基本一致（圖2-A）。進一步觀察0.01 μmol/L 2，4-D處理4 d以后的側(cè)根變化，OsRPK1抑制表達植株AX側(cè)根的數(shù)量比野生型多112%（P<0.01）（圖1-B），而OsRPK1過表達植株OX側(cè)根的發(fā)生受到顯著抑制（P<0.001）（圖1-C）。0.1 μmol/L 2，4-D 處理10 d以后，抑制表達植株AX的不定根數(shù)量相對于野生型WT多18.2%，差異顯著（P<0.05）（圖2-C），而過表達植株OX的不定根發(fā)生受到顯著抑制，與野生型相比差異極顯著（P<0.01）（圖2-C）。以上結(jié)果表明，在水稻中OsRPK1表達量的改變能影響水稻側(cè)根的發(fā)生，外源生長素2，4-D處理情況下，OsRPK1[STBZ]負調(diào)控水稻側(cè)根和不定根的發(fā)生，這暗示了OsRPK1[STBZ]可能參與生長素生理反應來調(diào)節(jié)水稻根部的生長發(fā)育。

2.2原核表達載體pGEX-LRRs的構(gòu)建

設計特異性引物擴增OsRPK1胞外富亮氨酸重復序列LRRs，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后顯示大小為 1 600 bp 左右，與預期值1598 bp相符（圖3-A）。回收目的片段和原核表達載體pGEX-4T-1，分別用NotⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，T4連接酶連接后構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-LRRs，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌株，篩選陽性單克隆后提取質(zhì)粒進行 NotⅠ 和BamHⅠ雙酶切驗證，酶切產(chǎn)物是1 600 bp左右的LRRs片段和pGEX-4T-1線性化載體，結(jié)果顯示酶切產(chǎn)物大小與理論值相符（圖3-B）。陽性克隆進行DNA測序鑒定，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列一致，無堿基突變或缺失，說明pGEX-LRRs原核表達載體構(gòu)建成功。

2.3富亮氨酸重復序列LRRs體外原核表達

將重組質(zhì)粒pGEX-LRRs轉(zhuǎn)化BL21（DE3）菌株感受態(tài)，嘗試在不同溫度、不同濃度IPTG條件下誘導融合蛋白表達，選定37 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導4 h作為蛋白表達條件，表達得到的蛋白通過SDS-PAGE進行檢測（圖4），第1泳道為未加IPTG誘導的陰性對照，2泳道為加0.1 mmol/L IPTG誘導后的表達蛋白，且蛋白大小與目的蛋白大?。?1.7 ku）相吻合，說明融合蛋白GST-LRRs在BL21（DE3）表達菌株中成功表達。進一步分析，如圖5所示，1泳道為IPTG誘導蛋白表達后菌液經(jīng)離心收集的上清液，上清液里未檢測到融合蛋白，說明GST-LRRs融合蛋白在大腸桿菌中以不溶性的、無活性的包涵體形式存在。為了得到有活性的可溶性融合蛋白，首先對其進行變性溶解，然后再將其復性，4泳道是復性后獲得的高純度的GST-LRRs融合蛋白，此蛋白可以滿足后續(xù)試驗的要求。

2.4融合蛋白GST-LRRs與外源生長素相互作用分析

利用100 nmol/L H3-IAA和0、0.1、1.0、10.0 μmol/L不同濃度的IAA競爭結(jié)合10 μg融合蛋白GST-LRRs，用磷酸緩沖液洗脫未被結(jié)合的H3-IAA和IAA，Beckman液閃儀讀取與融合蛋白結(jié)合的H3-IAA放射性活度。結(jié)果如圖6所示，只有100 nmol/L H3-IAA時，和GST-LRRs結(jié)合后，放射性活度測得為918.6 d.p.m，隨著未被同位素標記的IAA濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L） 的遞增與100 nmol/L H3-IAA競爭結(jié)合GST-LRRs，放射性活度分別測得為870.5、840.3、1 027.6 d.p.m，IAA競爭H3-IAA結(jié)合融合GST-LRRs后放射性活度無顯著性差異（P>0.05），說明IAA競爭結(jié)合 GST-LRRs也未改變GST-LRRs與H3-IAA的結(jié)合量，這些結(jié)果表明融合蛋白GST-LRRs未與生長素發(fā)生直接結(jié)合。

等溫滴定量熱ITC法通過類似化學滴定的方法，分析2個物質(zhì)之間相互作用的微熱量變化以研究分子相互作用，廣泛用于檢測蛋白質(zhì)與小分子相互作用[25-27]。圖7-A顯示的是連續(xù)等溫線5 μmol/L IAA溶液滴定至100 μmol/L GST-LRRs融合蛋白溶液后的補償功率變化。使用數(shù)據(jù)分析軟件Origin 7.0對原始數(shù)據(jù)進行積分和標準化處理，如圖 7-B 所示，得到反應熱隨摩爾比的變化函數(shù)圖呈散點狀，說明IAA不能結(jié)合GST-LRRs融合蛋白。ITC法得到理想的試驗數(shù)據(jù)，需要反應的親和常數(shù)K值在103～108，而IAA和GST-LRRs可能是由于兩者的親和常數(shù)太低，熱量未被儀器檢測到，從而得不到兩者相互作用的信息。

3結(jié)論與討論

植物在不同生長發(fā)育階段會受到外界環(huán)境脅迫和體內(nèi)細胞間信號的影響，LRR-RLKs的胞外LRR結(jié)構(gòu)域能夠首先識別和接受來自胞外的信號，通過跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)庑盘杺鬟f至胞內(nèi)，引起細胞的生理生化反應。OsRPK1在前期被鑒定為一個新的具有激酶活性、定位于細胞膜的典型的 LRR-RLK，并且分析OsRPK1在植物激素處理下的表達模式表明，OsRPK1主要受生長素2，4-D和IAA誘導表達，并且 2，4-D誘導效果要比IAA稍顯著[20]。生長素是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一類重要的植物激素，在植物根部發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[28-29]。為了進一步研究OsRPK1與生長素的相關性，鑒于2，4-D誘導OsRPK1表達的效果比IAA稍顯著，并且2，4-D 化學性質(zhì)也比IAA穩(wěn)定，所以本研究選用2，4-D作為外源生長素，觀察外源生長素對OsRPK1表達量改變后水稻根部表型的影響。

水稻根系主要由大量的不定根及側(cè)根組成。外源生長素可促進側(cè)根的發(fā)生，但濃度過高則抑制側(cè)根原基的露出，Zhang等研究2，4-D對水稻側(cè)根長度的影響，利用不同濃度的2，4-D處理野生型和OsWRKY31過表達水稻，發(fā)現(xiàn) 0.01 μmol/L 的 2，4-D 處理萌發(fā)后水稻側(cè)根的發(fā)生在6 d時表型顯著[21];Inukai等研究crl1突變體時發(fā)現(xiàn)，0.01～0.10 μmol/L 的2，4-D對突變體側(cè)根的發(fā)生影響顯著[22]。因此，本研究結(jié)合前人研究結(jié)果選擇0.01 μmol/L的2，4-D作為觀察側(cè)根發(fā)生的作用濃度，結(jié)果表明0.01 μmol/L的2，4-D 處理4 d后，轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)根數(shù)量相對于野生型差異顯著。正常生長情況下，OsRPK1過表達轉(zhuǎn)基因植株相對于野生型的側(cè)根生長受到顯著抑制（P<0.01），在0.01 μmol/L 2，4-D處理4 d后的OsRPK1抑制表達植株側(cè)根的數(shù)量與野生型相比多112%（P<0.01），而OsRPK1過表達植株側(cè)根生長受到極顯著抑制（P<0.001）。Wang等研究OsCAND1[STBZ]對水稻不定根發(fā)生的影響，認為0.1 μmol/L 2，4-D處理7 d的水稻Oscand1[STBZ]突變體與野生型不定根的數(shù)量差異最為顯著[23]。本研究利用0.1 μmol/L 2，4-D處理水稻，發(fā)現(xiàn)10 d時水稻不定根差異明顯，抑制表達植株不定根的數(shù)量相對于野生型多18.2%（P<0.05），而過表達植株不定根的生長受到極顯著抑制（P<0.01）。這些表型和已報道的一些生長素相關的突變體表型極為相似，如生長素上調(diào)小RNA基因SAUR39負調(diào)控生長素合成和轉(zhuǎn)運，過表達SAUR39轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出側(cè)根的發(fā)生受到抑制[30];OsAGAP（ARF-GTP酶激活蛋白）能夠調(diào)節(jié)生長素內(nèi)流和根部發(fā)育，OsAGAP會破壞水稻中生長素的極性運輸，影響主根和側(cè)根的發(fā)育，OsAGAP過表達水稻幼苗側(cè)根發(fā)生比野生型水稻慢約2 d，OsAGAP轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在萌發(fā)后12 d的側(cè)根數(shù)約為野生型的50%，不定根的數(shù)量也明顯增多[31];在生長素信號轉(zhuǎn)導途徑中，Aux/IAA 發(fā)揮著非常重要的作用，Kitomi等研究也表明，Osiaa13突變體的側(cè)根數(shù)量受到明顯的抑制[32]。OsRPK1能影響部分生長素極性運輸相關基因[20]和部分生長素信號轉(zhuǎn)導途徑基因表達。這些結(jié)果表明，OsRPK1可能參與了生長素信號途徑或極性運輸途徑調(diào)節(jié)水稻根部的生長發(fā)育。

大量研究已表明生長素運輸抑制劑響應蛋白（TIR1）是生長素胞內(nèi)受體蛋白[17-18]，介導胞內(nèi)的生長素信號轉(zhuǎn)導，但識別外源生長素的受體至今仍未發(fā)現(xiàn)。OsRPK1作為一個典型的LRR-RLK，其胞外富亮氨酸重復LRRs可能與外源生長素相互作用，胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域通過磷酸化作用將信號傳遞給下游生長素響應蛋白，從而調(diào)節(jié)水稻側(cè)根和不定根的生長。因此本研究將OsRPK1蛋白的LRRs通過原核系統(tǒng)異源表達，在體外觀察OsRPK1的LRRs結(jié)構(gòu)域是否與生長素結(jié)合。同位素H3標記的IAA與未被同位素標記的IAA競爭結(jié)合試驗可以判斷一個蛋白是否與生長素結(jié)合[17-18]，同時利用等溫滴定微量熱（ITC）法測定兩者在體外作用的微熱量變化，試驗結(jié)果都表明GST-LRRs并未與外源生長素結(jié)合。

現(xiàn)有的研究表明LRR-RLKs受體激活的機制主要有2類：一類以油菜素內(nèi)酯受體BRI1和鞭毛蛋白受體FLS2為代表，通過配體的“膠聯(lián)”作用結(jié)合共受體形成異源二聚體來激活受體[7-11];另一類是以植物磺化肽激素受體PSKR為代表，主要通過配體別構(gòu)誘導受體構(gòu)象變化來介導受體與其共受體SERK相互作用激活受體[14，33]。在這2種不同的受體激活模式中，涉及的受體和共受體均是LRR型類受體蛋白激酶。更有趣的是現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的共受體幾乎都是SERK蛋白，一個共受體如何促進不同配體的特異性結(jié)合和激活不同的LRR型受體蛋白激酶尚不清楚[34]。最近科學家在擬南芥中使用高敏感、高通量相互作用分析法，研究了4萬個潛在的細胞表面受體胞外結(jié)構(gòu)域的相互作用，構(gòu)建了由567個相互作用組成的LRR的細胞表面相互作用網(wǎng)絡[35]。由此可見，LRR-RLKs在植物生長發(fā)育過程中功能行使的機制是多樣化的，且不同的LRR-RLKs在配體識別過程中扮演的角色也有區(qū)別，有的LRR-RLKs直接與配體結(jié)合，有的只是作為共受體與受體結(jié)合來幫助受體識別配體。雖然在體外試驗中未證明融合蛋白GST-LRRs與外源生長素直接結(jié)合，一方面可能是因為原核表達系統(tǒng)異源表達，缺乏蛋白翻譯后加工修飾，可能導致表達的蛋白沒有生物學活性，體外試驗不能夠完全模擬體內(nèi)環(huán)境。另一方面可能是OsRPK1作為復雜的細胞表面互作網(wǎng)絡的一員，發(fā)揮作用需要結(jié)合其他蛋白或復合物才能和外源生長素直接或間接作用，這也將是以后研究OsRPK1參與生長素信號途徑和極性運輸途徑需要重點解決的問題。

參考文獻：

[1]查笑君，馬伯軍，潘建偉，等. 植物富亮氨酸重復類受體蛋白激酶的研究進展[J]. 浙江師范大學學報（自然科學版），2010，33（1）：7-12.

[2]Liu P L，Du L，Huang Y，et al. Origin and diversification of leucine-rich repeat receptor-like protein kinase （LRR-RLK） genes in plants[J]. BMC Evolutionary Biology，2017，17（1）：47.

[3]Hohmann U，Lau K，Hothorn M. The structural basis of ligand perception and signal activation by receptor kinases[J]. Annual Review of Plant Biology，2017，68（1）：109-137.

[4]Song W，Han Z F，Wang J Z，et al. Structural insights into ligand recognition and activation of plant receptor kinases[J]. Current Opinion in Structural Biology，2017，43：18-27.

[5]Lee S W，Han S W，Sririyanum M，et al. A typeⅠ-secreted，sulfated peptide triggers XA21-mediated innate immunity[J]. Science，2013，342（6155）：850-853.

[6]Song W Y，Wang G L，Chen L L，et al. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene，Xa21[J]. Science，1995，270（5243）：1804-1806.

[7]Nam K H，Li J M. BRI1/BAK1，a receptor kinase pair mediating brassinosteroid signaling[J]. Cell，2002，110（2）：203-212.

[8]Oh M H，Clouse S D，Huber S C. Tyrosine phosphorylation of the BRI1 receptor kinase occurs via a post-translational modification and is activated by the juxtamembrane domain[J]. Frontiers in Plant Science，2012，3：175.

[9]Oh M H，Wang X F，Kota U，et al. Tyrosine phosphorylation of the BRI1 receptor kinase emerges as a component of brassinosteroid signaling in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（2）：658-663.

[10]Gomez-Gomez L，Bauer Z，Boller T. Both the extracellular leucine-rich repeat domain and the kinase activity of FSL2 are required for flagellin binding and signaling in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2001，13（5）：1155-1163.

[11]Sun Y D，Li L，Macho A P，et al. Structural basis for flg22-induced activation of the Arabidopsis FLS2-BAK1 immune complex[J]. Science，2013，342（6158）：624-628.

[12]Gish L A，Clark S E. The RLK/pelle family of kinases[J]. Plant Journal，2011，66（1）：117-127.

[13]Kinoshita A，Betsuyaku S，Osakabe Y，et al. RPK2 is an essential receptor-like kinase that transmits the CLV3 signal in Arabidopsis[J]. Development，2010，137（22）：3911-3920.

[14]Song W，Liu L，Wang J Z，et al. Signature motif-guided identification of receptors for peptide hormones essential for root meristem growth[J]. Cell Research，2016，26（6）：674-685.

[15]Lavy M，Estelle M. Mechanisms of auxin signaling[J]. Development，2016，143（18）：3226-3229.

[16]Ruegger M，Dewey E，Hobbie L，et al. Reduced naphthylphthalamic acid binding in the tir3 mutant of Arabidopsis is associated with a reduction in polar auxin transport and diverse morphological defects[J]. Plant Cell，1997，9（5）：745-757.

[17]Dharmasiri N，Dharmasiri S，Estelle M. The F-box protein TIR1 is an auxin receptor[J]. Nature，2005，435（7041）：441-445.

[18]Kepinski S，Leyser O. The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an auxin receptor[J]. Nature，2005，435（7041）：446-451.

[19]Gao Y B，Zhang Y，Zhang D，et al. Auxin binding protein 1 （ABP1） is not required for either auxin signaling or Arabidopsis development[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（7）：2275-2280.

[20]Zou Y，Liu X Y，Wang Q，et al. OsRPK1，a novel leucine-rich repeat receptor-like kinase，negatively regulates polar auxin transport and root development in rice[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - General Subjects，2014，1840（6）：1676-1685.

[21]Zhang J，Peng Y C，Guo Z. Constitutive expression of pathogen-inducible OsWRKY31 enhances disease resistance and affects root growth and auxin response in transgenic rice plants[J]. Cell Research，2008，18（4）：508-521.

[22]Inukai Y，Sakamoto T，Ueguchi-Tanaka M，et al. Crown rootless1，which is essential for crown root formation in rice，is a target of an auxin response factor in auxin signaling[J]. Plant Cell，2005，17（5）：1387-1396.

[23]Wang X F，He F F，Ma X X，et al. OsCAND1 is required for crown root emergence in rice[J]. Molecular Plant，2010，4（2）：289-299.

[24]Lewis E A，Murphy K P. Isothermal titration calorimetry[J]. Methods in Molecular Biology，2005，305（3）：1-16.

[25]Frazier R A，Papadopoulou A，Green R J. Isothermal titration calorimetry study of epicatechin binding to serum albumin[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006，41（5）：1602-1605.

[26]Singh S K，Kishore N. Thermodynamic insights into the binding of Triton X-100 to globular proteins：a calorimetric and spectroscopic investigation[J]. The Journal of Physical Chemistry B，2006，110（19）：9728-9737.

[27]齊心潔，王玥，王彥晟，等. 等溫滴定量熱法在蛋白質(zhì)-配體相互作用中的應用[J]. 生物技術通報，2017，33（5）：40-49.

[28]Peret B，De Rybel B，Casimiro I，et al. Arabidopsis lateral root development：an emerging story[J]. Trends in Plant Science，2009，14（7）：399-408.

[29]Peret B，Li G W，Zhao J，et al. Auxin regulates aquaporin function to facilitate lateral root emergence[J]. Nature Cell Biology，2012，14（10）：991-998.