董震宇　曾嶸　肖海兵　胡志偉

摘要：為了明確枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）粗酶液對Cry1Ac毒蛋白質(zhì)的降解特征，采用蛋白質(zhì)凝膠電泳[十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）]和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），在不同溫度和pH值條件下測定該菌粗酶液降解Cry1Ac蛋白質(zhì)的特性。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌主要以胞外酶液降解Cry1Ac蛋白質(zhì)，胞外粗酶液在 40 ℃、pH值為10的條件下對Cry1Ac蛋白質(zhì)的降解效果最佳，粗酶液S1對Cry1Ac蛋白質(zhì)降解的米氏常數(shù)（Km）為2.099 4 μg/L，最大反應(yīng)速度（Vmax）為0.239 58 μg/（L·min）。在降解45 min時，Cry1Ac蛋白質(zhì)含量由4.987 μg/L降至0.159 μg/L，其降解程度達(dá)極顯著水平（P<0.01），其降解率為96.815%?？莶菅挎邨U菌的胞外酶液主要發(fā)揮降解Cry1Ac蛋白質(zhì)的作用，其粗酶液對Cry1Ac蛋白質(zhì)的降解最適條件為40 ℃、pH值為10以及Km為2.099 4 μg/L。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌;Cry1Ac蛋白質(zhì);棉田土壤;降解細(xì)菌;降解能力

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0273-03

轉(zhuǎn)Cry1Ac基因棉產(chǎn)生的Cry1Ac殺蟲蛋白質(zhì)可以降低棉鈴蟲等鱗翅目害蟲的危害程度，減輕農(nóng)藥對環(huán)境的污染。因其優(yōu)勢，轉(zhuǎn)Bt基因棉種植面積日趨擴(kuò)大[1]。但Cry1Ac殺蟲蛋白質(zhì)可經(jīng)轉(zhuǎn)Cry1Ac基因作物根系分泌物或作物殘留等形式進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，殘留于土壤而影響土壤微生物類群和多樣性[2]。Cry1Ac蛋白質(zhì)與土壤顆粒緊密結(jié)合不易降解[3]，而轉(zhuǎn)Bt基因棉粉碎還土能促使土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量顯著增加[4]。土壤生態(tài)環(huán)境具有一定抗風(fēng)險能力，其土壤微生物可促進(jìn)Bt蛋白質(zhì)的降解[5]。新疆阿克蘇鹽堿地土壤細(xì)菌資源豐富，已分離培養(yǎng)鹽堿地土壤中的細(xì)菌103株[6]，其中分離得到的枯草芽孢桿菌對Cry1Ac蛋白質(zhì)降解效果明顯[7]，但目前對新疆棉田Cry1Ac蛋白質(zhì)的降解研究較為鮮見。因而對Cry1Ac毒蛋白質(zhì)降解細(xì)菌的降解特征分析將對長期種植轉(zhuǎn)Bt棉田的土壤生態(tài)治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株為枯草芽孢桿菌菌株（Bacillus subtilis），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離[7]。[LM]

1.1.2 主要試劑及儀器

蛋白胨和牛肉膏（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;十二烷基硫酸鈉（SDS）、NaCl、H2O2、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、溴酚藍(lán)、甘油、甲醇、無水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）;瓊脂（海南省瓊海市長青瓊脂廠）;丙烯酰胺、過硫酸氨、甘氨酸（電泳級）、冰乙酸和考馬斯亮藍(lán)（R250）（天津博迪化工股份有限公司）;三羥甲基氨基甲烷（天津市鼎盛鑫化工有限公司）;N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）（天津市大茂化學(xué)試劑廠）;Cry1Ac蛋白質(zhì)（純度96%）及其酶聯(lián)免疫試劑盒（上海佑隆生物科技有限公司）;蛋白質(zhì)電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;恒溫恒濕培養(yǎng)箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;Sky-1102C型全溫度恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）;FC型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];超純水機(jī)（成都優(yōu)普生物科技有限公司）;超聲波破碎儀（德國耶拿分析儀器股份公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，瓊脂1.5%，pH值為7.2～7.4。NB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH值為7.2～7.4。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解菌粗酶液的制備及降解酶的定位

取純培養(yǎng)菌液離心（5 000 r/min，5 min），取上清液（S1）凍存;離心管內(nèi)加無菌水，冰浴中超聲波破碎細(xì)胞（工作5 s，間隔5 s，破碎 10 min），離心（5 000 r/min，5 min）后，取上清液（S2）凍存，即S1為胞外酶提取液，S2為胞內(nèi)酶提取液[8]。將S1和S2酶液分別處理Cry1Ac蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測其酶的降解效果[5]。

1.2.2 降解菌的降解特性研究

檢測不同溫度對粗酶液S1活性的影響。取S1上清液90 μL于1.5 mL離心管中，然后加入10 μL Cry1Ac蛋白質(zhì)（5 μg/L），分別于20、25、30、35、40、45 ℃ 的水浴中反應(yīng)45 min，同時設(shè)不加酶液的離心管作為對照處理。同理，檢測pH值對酶活性的影響，配制不同pH值的緩沖液，pH值分別設(shè)為5、6、7、8、9、10、11，取90 μL不同pH值的S1緩沖液于1.5 mL離心管中，加入10 μL Cry1Ac蛋白質(zhì)（5 μg/L），40 ℃水浴45 min，分別測定D450 nm[9-10]。

在最適條件下，在離心管內(nèi)加入90 μL酶液，然后加入不同濃度的Cry1Ac蛋白質(zhì)標(biāo)品10 μL，最初的Cry1Ac蛋白質(zhì)底物濃度分別為0.500、0.625、1.250、2.500和5.000 μg/L，于40 ℃反應(yīng) 10 min。利用雙倒數(shù)作圖法，求得粗酶液S1對Cry1Ac蛋白質(zhì)降解的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax[11-12]。

1.2.3 降解菌株對Cry1Ac蛋白質(zhì)降解能力的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量分析Cry1Ac蛋白質(zhì)含量，分析降解菌對Cry1Ac蛋白質(zhì)的降解作用能力[5]。取S1上清液 90 μL 于1.5 mL離心管中，然后加入10 μL Cry1Ac蛋白質(zhì)（μg/L），分別在40 ℃、pH值為10.0的條件下反應(yīng)10、45 min，分別測定D450 nm。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用Cry1Ac蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其相應(yīng)濃度，米氏方程公式為V=（Vmax×[S]）/（Km+[S]）[13]。采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和Duncan's新復(fù)極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解酶的定位

在分離的枯草芽孢桿菌S1、S2中，胞外酶液S1無明顯電泳條帶顯示，而胞內(nèi)酶液S2和對照組均呈現(xiàn)不同亮度的電泳條帶（圖1）。這說明枯草芽孢桿菌菌株胞外酶S1能明顯地降解Cry1Ac蛋白質(zhì)。另外，Cry1Ac蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和胞內(nèi)酶液S2處理均在70 ku附近有明顯電泳條帶，Cry1Ac蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為65 ku。

2.2 降解粗酶液S1的酶促降解特性

由圖2可知，pH值為10時，枯草芽孢桿菌粗酶液S1處理的Cry1Ac蛋白質(zhì)含量降至最低值，為0.365 μg/L，與其他各pH值處理相比差異顯著（P<0.05）。pH值為6時降解程度次之，Cry1Ac蛋白質(zhì)含量降為0.417 μg/L，均與其他各處理間差異顯著（P<0.05），因此，該粗酶液S1在堿性條件下的最適降解pH值為10，其次為酸性條件下，pH值為6。

由圖3可知，40 ℃時，枯草芽孢桿菌粗酶液S1處理的Cry1Ac蛋白質(zhì)含量降至最低值，為0.387 μg/L，與20、25、30 ℃ 處理相比差異極顯著（P<0.01），但與35、45 ℃處理間無明顯差異。因此，該粗酶液S1在40 ℃左右時條件較適宜。

由表1可得，一定濃度粗酶液S1，隨Cry1Ac蛋白質(zhì)底物濃度的升高，降解率大體上降低，其Cry1Ac蛋白質(zhì)底物濃度（x）與Cry1Ac蛋白質(zhì)剩余濃度（y）的函數(shù)關(guān)系為y=0.436 2x+0.230 2，r2=0.993 9，回歸模型擬合度較好。當(dāng)Cry1Ac蛋白質(zhì)底物濃度為0.500、0.625 μg/L時，二者降解率無顯著差異，但高于其他處理，達(dá)極顯著水平（P<0.01）。當(dāng)Cry1Ac蛋白質(zhì)底物濃度為1.250 μg/L時，降解率為59.96%， 其降解率顯著高于2.500、 5.000 μg/L處理組（P<0.05），說明2.500、5.000 μg/L處理組粗酶液S1的降解水平下降幅度較大。

由圖4可知，1/底物濃度（x）與1/反應(yīng)速率（y）的函數(shù)關(guān)系：y=8.762 8x+4.174 2，r2=0.954 3，回歸模型擬合度較高，經(jīng)計(jì)算得Vmax=0.239 58 μg/（L·min），Km=2.099 4 μg/L。

2.3 降解粗酶液S1對Cry1Ac蛋白質(zhì)降解能力的測定

由表2可知，經(jīng)降解粗酶液S1處理45 min后，Cry1Ac蛋白質(zhì)含量由4.987 μg/L降至0.159 μg/L，其降解率為 96.815%，其降解率顯著高于10 min處理組，達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌胞外粗酶液降解Cry1Ac蛋白質(zhì)的最適溫度為40 ℃，推測該粗酶液具有較好的耐熱性。這可能與阿拉爾墾區(qū)的氣溫較高有關(guān)[14]。另外，其降解最適降解pH值為10，Cry1Ac蛋白質(zhì)在堿性條件下易被降解，推測該菌對堿性土壤環(huán)境的耐受性較好，這可能與新疆阿拉爾墾區(qū)鹽堿地有關(guān)[6]。但在酸性條件下，pH值為6時的降解效果也比較好，這推測該胞外粗酶液可能存在2種及以上的酶類組成，各自降解酶特性還需進(jìn)一步分離純化等研究。因此，粗酶液的最適降解溫度為40 ℃，最適pH值為10。Km為 2.099 4 μg/L，Km值相對越小，該粗酶液S1與Cry1Ac蛋白質(zhì)結(jié)合較為親和。此外，枯草芽孢桿菌菌株粗酶液在最適降解條件下，對Cry1Ac蛋白質(zhì)處理45 min后，其降解率為 96.82%，這與肖海兵等在37 ℃、1 h條件下降解率為 92.26% 的研究結(jié)果[7]相近，其降解活性較高，對Cry1Ac有較好的降解效果。此外，本研究未對重金屬等因素的影響進(jìn)行檢測，在土壤綜合環(huán)境條件下是否也同樣具有較高的降解活性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖海兵，王鵬軍，李先鋒，等. 轉(zhuǎn)Bt棉主莖葉Cry1Ab/c蛋白含量的時空分布分析[J]. 生物技術(shù)通報，2017，33（12）：108-111.

[2]張美俊，段 云，楊武德，等. 轉(zhuǎn)Bt基因棉粉碎葉還土對土壤微生物活性的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，33（2）：93-97，135.

[3]邢福國，劉 陽，喬文靜. 轉(zhuǎn)Bt基因作物毒素蛋白降解特性研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（16）：3244-3248，3256.

[4]周家憲. 豬糞便中伊維菌素的排泄及降解規(guī)律[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2011.

[5]趙輝欣，劉 陽，邢福國. Cry1Ac蛋白降解菌株FJSB3的分離鑒定及降解特性[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2011，25（5）：922-926.

[6]李良秋，鄭賀云，蔡卓平，等. 新疆阿克蘇鹽堿地土壤細(xì)菌的分離研究[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展，2013，3（4）：281-287.

[7]肖海兵，董震宇，董紅強(qiáng)，等. 棉田Cry1Ac蛋白降解菌株12T-103的分離鑒定及降解能力研究[J]. 塔里木大學(xué)學(xué)報，2018，30（4）：59-63.

[8]張錦華，臧三麗，白寶清，等. 檸檬苦素降解菌C6降解特性及活性降解酶的分離純化[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（2）：143-151.

[9]陳貝貝，董紅強(qiáng)，曹志恒，等. 氟樂靈降解菌Bacillus sp.的分離鑒定及其降解特性[J]. 農(nóng)藥，2017，56（1）：30-35.

[10]田連生. 木霉T2-2產(chǎn)多菌靈水解酶的條件及酶學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：577-578.

[11]常 英，張冬艷，胡建華，等. ErCl3作用下枯草桿菌所產(chǎn)α-淀粉酶的溫度、pH性質(zhì)[J]. 蘭州理工大學(xué)學(xué)報，2009，35（6）：76-78.

[12]高永生，朱麗云，朱貴州，等. 枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶規(guī)律及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（19）：11964-11965，11968.

[13]李 麗，施 展，錢春香. 酶動力學(xué)模塊軟件求解米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 洛陽理工學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，19（4）：1-3，15.

[14]鄧 雁，李新平，崔方讓. 新疆阿克蘇農(nóng)一師北二干鹽堿荒地土壤系統(tǒng)分類研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006（1）：113-116.