畢志學(xué) 胡標(biāo)猛 林 淼

（湖北省麻城市張家畈畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，湖北麻城 438300）

豬偽狂犬?。╬orcine pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（PRV，豬皰疹病毒Ⅳ型）引起的多種家畜、野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎為主要臨床癥狀的急性傳染病。豬是該病的自然宿主和主要傳染源[1]。我國自 1948年劉永純報(bào)道該病以來，在多個(gè)?。ㄊ校┝餍?。雖然我國大多數(shù)規(guī)?；i場采取了豬偽狂犬的凈化措施，但是由于我國養(yǎng)殖環(huán)境較為復(fù)雜，2012年以來豬偽狂犬病的發(fā)生在我國呈由北向南逐漸蔓延的趨勢，說明偽狂犬病已依然是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。

2019年4月份XX地區(qū)規(guī)?；i場疑似出現(xiàn)豬偽狂犬病的疫情，母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔，7日齡以內(nèi)仔豬多表現(xiàn)為口吐白沫，四肢呈劃水樣，頭向后仰等臨診癥狀，剖檢病豬多可見扁桃體發(fā)生潰瘍，肝臟表面出現(xiàn)大小不等的灰白色壞死灶，腎臟表面有大小不等的點(diǎn)狀出血。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)該豬場進(jìn)行血清學(xué)和病原學(xué)的檢測，確定此次疫情是由豬偽狂犬病毒變異株引起，并通過緊急免疫等手段成功的控制了疫情的蔓延，同時(shí)為養(yǎng)殖戶挽救巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集與處理

隨機(jī)抽取30份發(fā)病與正常母豬待檢血清，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采集自XX地區(qū)某規(guī)?；i場流產(chǎn)胎兒、死胎及發(fā)病仔豬的腦、扁桃體、肺臟等組織，加適量滅菌的PBS液，研磨制成1：10的混懸液，反復(fù)凍融3次后在4℃條件下5000 r/min離心10 min，收集上清。置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

病毒 DNA/RNA 提取試劑盒、2 × EX Taq PCR 購自、DNA Marker DL2000 等購自 TaKaRa 公司；豬偽狂犬野毒抗體檢測試劑盒為IDEXX公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成

參考王宇等人發(fā)表的豬偽狂犬病毒gE基因合成2對(duì)豬偽狂犬病毒gE基因的特異性引物F1：5′-GACCATGCGGCCCTTTCTGC-3′，R1：5 ′ -GGTCCACCGGGCGCAGGCACTGC-3 ′；F2：5 ′ -GCCCCCGCGGTGCCTGCTGTA-3 ′，R2：5′-GTATTTAAGCGGGGCGGGACATCA-3′，其擴(kuò)增目的片段大小分別為為890bp、850bp。引物送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2 血清學(xué)診斷

對(duì)發(fā)病豬群隨機(jī)采集30份血清，其中編號(hào)1～10號(hào)為流產(chǎn)母豬血清，11-25號(hào)為正常母豬血清，26～30號(hào)為發(fā)病仔豬血清。按照IDEXX公司豬為狂犬野毒抗體檢測試劑盒說明書對(duì)待檢血清進(jìn)行檢測。

1.2.3 基因組DNA的提取

采集自XX地區(qū)某規(guī)?；i場流產(chǎn)胎兒、死胎及發(fā)病仔豬的腦、扁桃體、肺臟等組織無菌條件下充分研磨，反復(fù)凍溶3次后，在4 ℃條件下12000 r/min離心10 min，取200 μl上清液于滅菌的1.5 ml離心管中，用X公司的動(dòng)物血液/組織/分泌物/培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA/RNA提取試劑盒按步驟提取病毒DNA，并以提取的病毒基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及程序

反應(yīng)體系為50μl：2×EX Taq酶25 μl，上、下游引物各2 μl，DNA 模板 4 μl，滅菌雙蒸水 17 μl。

反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃變性50 s，63℃ 退火50 s，72 ℃延伸100 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μlCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，觀察目的條帶大小。

1.2.5 序列測定及生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒純化回收目的片段，樣品送進(jìn)行序列測定，并利用DNAStar中的MegAlign等分子生物學(xué)軟件進(jìn)行核苷酸序列及氨基酸序列遺傳變異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果

血清豬偽狂犬病毒檢測結(jié)果顯示，流產(chǎn)母豬豬為狂犬野毒抗體陽性率為100%，其感染后S/N值抗體水平處于感染中后期的抗體水平，仔豬陽性率為80%，其感染后S/N值相對(duì)處于一個(gè)感染初期的抗體水平，無異常母豬群陽性率47%。

（備注：S/N≤0.6判為陽性；S/N＞0.7判為陰性；0.7≥S/N＞0.6判為可疑。）

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用設(shè)計(jì)的2對(duì)特異性引物，通過PCR方法從采集的發(fā)病豬組織樣品中分別擴(kuò)增出F1/R1、F2/R2基因，其擴(kuò)增片段大小分別為890bp、850bp，與預(yù)期大小相符（見圖1）。

圖1 PRV gE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 序列分析

利用ContigExpress軟件對(duì)1株豬偽狂犬病毒毒株F1/R1、F2/R2分段擴(kuò)增的gE基因進(jìn)行全基因序列的拼接，并與GenBank中已發(fā)表的豬偽狂犬病毒不同地區(qū)的代表株進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明分離的毒株全基因序列全長為1740bp，編碼個(gè)氨基酸。利用生物學(xué)軟件DNAStar對(duì)所獲得的1株P(guān)RV gE全基因序列之間及其國內(nèi)外分離毒株進(jìn)行核苷酸遺傳進(jìn)化樹分析及同源性比較。結(jié)果表明與國內(nèi)分離的JS-2012株、ZM株、HB1株、Xiang A株，及國外分離的Rac1株共同在一個(gè)分支上，說明本次檢測到的豬偽狂犬病毒與2011年后分離的變異毒株親緣關(guān)系較近。同時(shí)與國內(nèi)分離的經(jīng)典毒株LA、PRV-SH、Ea、GDSH、Min-A、P-PrV、Fa、SXJC2011毒株位于一個(gè)大的分支，說明本次檢測到的毒株與這些毒株存在一定的親緣關(guān)系，另外這些經(jīng)典毒株有部分已經(jīng)作為疫苗株在我國廣泛使用，說明以Ea株為代表的疫苗免疫產(chǎn)生的抗體能夠?qū)δ壳皣鴥?nèi)存在的豬偽狂犬病毒起到保護(hù)作用。而與國外代表毒株Becker、Nia-1、Kaplan等毒株不在一個(gè)分支上，說明與這些毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其以這些毒株為基礎(chǔ)生產(chǎn)的疫苗在一定程度上的免疫效果相對(duì)稍差。同源性分析顯示本次檢測到的豬偽狂犬病毒與近年分離的變異毒株JS-2012株、ZM株同源性為100%、與HB1、Xiang A、Rac1、LA、PRV-SH、Ea、GDSH、Min-A、P-PrV、Fa、SXJC2011等毒株同源性均在99%以上，而與國外國外代表毒株Becker、Nia-1、Kaplan等毒株同源性為96%以上，這些結(jié)果表明本次檢測到的豬偽狂犬病毒與近年分離的變異毒株同源性最高，與國外分離毒株同源性相對(duì)較低，說明本次檢測到的豬偽狂犬病毒為變異毒株。

3 討論

2011年以來，我國多個(gè)省份陸續(xù)報(bào)道了豬偽狂犬基因缺失疫苗免疫豬場發(fā)生豬偽狂犬病的疫情，新發(fā)豬偽狂犬病的發(fā)病率和死亡率明顯上升，且出現(xiàn)了新的發(fā)病特征[2]。據(jù)了解該豬場一直使用某進(jìn)口廠家Barth-K 61毒株疫苗，種豬群每年免疫4次，從2017年6月份種豬群豬偽狂犬野毒抗體出現(xiàn)大約5%陽性率，后調(diào)整免疫劑量和免疫程序，生產(chǎn)處于相對(duì)較為穩(wěn)定狀態(tài)，直到今年3月份，母豬群突然出現(xiàn)大面積的流產(chǎn)現(xiàn)象，仔豬出現(xiàn)典型的偽狂犬感染癥狀，檢測結(jié)果顯示豬偽狂犬野毒抗體陽性率已從5%上升為70%，豬偽狂犬病毒為陽性。序列分析表明豬群存在的豬偽狂犬病毒與國內(nèi)近年分離的變異毒株JS-2012株、ZM株同源性為100%、與其他國內(nèi)分離毒株同源性均達(dá)到99%以上，與JS-2012株的親緣關(guān)系最近，說明此次感染的豬偽狂犬病毒為變異毒株。針對(duì)此次疫情的發(fā)生，全群選用國產(chǎn)某廠家的豬偽狂犬病毒3基因缺失弱毒疫苗和滅活疫苗進(jìn)行緊急免疫，疫情逐漸得到有效控制。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有不同毒株的國產(chǎn)和進(jìn)口疫苗免疫后產(chǎn)生的中和抗體對(duì)新分離的豬偽狂犬病毒毒株中和能力較差，不足以提供完全保護(hù)，表明變異毒株可能存在一定的抗原變異[3]。豬偽狂犬病疫情在近年來的發(fā)生可能跟我國的養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)系，主要是中小規(guī)模養(yǎng)殖場缺乏有效的生物安全防范意識(shí)，疫苗接種不到位，免疫程序不合理，生長商品豬長期處于免疫抗體空白期等因素導(dǎo)致疫情的發(fā)生率居高不下。因此筆者建議中小規(guī)模養(yǎng)殖場一定要加強(qiáng)生物安全防范意識(shí)，做好后備豬引種的監(jiān)測，定期對(duì)整個(gè)豬群進(jìn)行抗體水平的監(jiān)測工作，制定合理的免疫程序，選擇免疫效果好、抗原含量高的疫苗進(jìn)行免疫，采取綜合性的、系統(tǒng)性的防控手段才能有效控制豬偽狂犬病的發(fā)生，最終做到豬偽狂犬病的凈化。

圖2 PRV gE 基因核苷酸同源性分析