沈鏈鏈 鐘義紅 徐 彬 靳蘇香 王玉邦

(南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心,江蘇南京 211166)

血細(xì)胞分析儀是對(duì)血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，同時(shí)可以得到血紅蛋白濃度，紅細(xì)胞壓積等與血液有關(guān)的數(shù)據(jù)，能有效的幫助篩查異常樣本，提供可靠的診斷依據(jù)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诘膭?dòng)物而言，通常對(duì)動(dòng)物麻醉后連續(xù)采集幾份血樣做不同的分析，如血細(xì)胞分析、生化分析或血凝分析等。而目前暫無研究證明先采的血標(biāo)本與后采的血標(biāo)本在血常規(guī)指標(biāo)上有無差異。本實(shí)驗(yàn)用雌雄大鼠各10只，每只大鼠用水合氯醛麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，用EDTA-抗凝管連續(xù)收集5份血液標(biāo)本用于血液分析，對(duì)比血常規(guī)的各項(xiàng)指標(biāo)有無差異。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

SPF級(jí)健康離乳SD大鼠購自上海西普爾-碧凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)，溫度20-26℃，相對(duì)濕度40%-70%，飼料購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，自由飲水和飲食。

1.2 儀器

Advia2120i全自動(dòng)血液分析儀購自西門子。

1.3 材料

EDTA-真空抗凝管購自江蘇康健醫(yī)療用品有限公司。

1.4 方法

大鼠正常飼養(yǎng)30d后，隔夜禁食。10%水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈用采血針采血收集至真空采血管，收集血液1ml 左右立即取新的真空采血管收集血液，共連續(xù)采血5管。

全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)：用西門子advia 2120i進(jìn)行血液學(xué)分析，種屬選擇大鼠，自動(dòng)進(jìn)樣模式檢測(cè)。手工計(jì)數(shù)方法：參考全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第3版）[1]完成。取小試管一支，加入白細(xì)胞稀釋液0.38ml（白細(xì)胞稀釋液：冰乙酸2ml，蒸餾水98ml，10 g/L 亞甲藍(lán)溶液3滴，混勻后過濾），用移液器吸取血液20μl，擦去沾的血，將血液打入白細(xì)胞稀釋液混勻，待紅細(xì)胞完全破壞，液體變?yōu)樽睾稚?，再次混勻充池，靜置3分鐘后，待白細(xì)胞下沉。用低倍鏡計(jì)數(shù)四角四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線細(xì)胞按數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)，白細(xì)胞數(shù)/l =（N/4）*10*20*106=（N/20）*109。

用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，后一份血標(biāo)本的均數(shù)與前一份血標(biāo)本的均數(shù)用配對(duì)T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

2 結(jié)果

2.1 儀器檢測(cè)白細(xì)胞數(shù)值

雌、雄大鼠各10只，每只大鼠采5份血液標(biāo)本，共100個(gè)數(shù)據(jù)。隨著采血順序的延后，白細(xì)胞的數(shù)值呈下降趨勢(shì)。紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板等其它指標(biāo)均未觀察到顯著差異。除了2例雌性大鼠，1例雄性大鼠的第4管血樣的白細(xì)胞數(shù)小于第5管，其余的數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)出隨著采血次序的延后，白細(xì)胞呈下降趨勢(shì)。各采血順序的血樣的均值和標(biāo)準(zhǔn)差見表1。

表1 儀器檢測(cè)白細(xì)胞值（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2 手工計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)值

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該數(shù)據(jù)的可靠性，又進(jìn)一步進(jìn)行手工計(jì)數(shù)（手工計(jì)數(shù)只計(jì)數(shù)了白細(xì)胞總數(shù)，未進(jìn)行分類計(jì)算百分比）。除了1例雌性大鼠第4管血樣的白細(xì)胞數(shù)小于第5管，1例雌性大鼠第3管血樣的白細(xì)胞數(shù)小于第4管，3例雄性大鼠第4管血樣的白細(xì)胞數(shù)小于第5管，其余的數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)出隨著采血次序的延后，白細(xì)胞呈下降趨勢(shì)。各采血順序的血樣的均值和標(biāo)準(zhǔn)差見表2。

表2 手工計(jì)數(shù)白細(xì)胞值（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.3 根據(jù)儀器檢測(cè)白細(xì)胞值計(jì)算每管血相對(duì)于上一管血的變化率

根據(jù)儀器自動(dòng)分析的白細(xì)胞值，按公式計(jì)算每管血樣相對(duì)于上一管血的白細(xì)胞值的變化百分比，結(jié)果見表3。

表3 由儀器檢測(cè)的白細(xì)胞值計(jì)算的變化率

以此類推。

2.4 根據(jù)手工計(jì)數(shù)白細(xì)胞值計(jì)算每管血相對(duì)于上一管血的變化率

根據(jù)手工計(jì)數(shù)的白細(xì)胞值，按公式計(jì)算每管血樣相對(duì)于上一管血的白細(xì)胞值的變化百分比，結(jié)果見表4。

表4 由手工計(jì)數(shù)的白細(xì)胞值計(jì)算的變化率

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，隨著采血順序的延后，白細(xì)胞的數(shù)值呈下降趨勢(shì)。儀器計(jì)數(shù)顯示，這種下降主要由于中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)值下降引起，這兩者相加約占白細(xì)胞總數(shù)的95%以上。其余的單核細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞由于絕對(duì)值和百分比都相對(duì)較小，未觀察到明顯的變化。

本次研究中也出現(xiàn)了幾例前一管血標(biāo)本的白細(xì)胞數(shù)值小于后一管的現(xiàn)象，但都是順序靠后的血標(biāo)本（如第3管血相對(duì)于第4管血，第4管血相對(duì)于第5管血），造成這種現(xiàn)象可能有如下原因：1，靠后的血標(biāo)本采血過程相對(duì)較慢，血液流速降低，可能會(huì)產(chǎn)生一些較小的血凝塊，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。2，靠后的血標(biāo)本本身的白細(xì)胞數(shù)值已經(jīng)很低，較小的隨機(jī)誤差（儀器檢測(cè)或者手工檢測(cè)）即可產(chǎn)生影響。因此這些結(jié)果不足以影響本次研究的結(jié)論。

筆者推測(cè)白細(xì)胞的這種下降趨勢(shì)可能與失血造成的體內(nèi)環(huán)境的改變有關(guān)。王君等發(fā)現(xiàn)失血易引起血漿IL-6、IL-8、TNF-α和NOS水平升高[2]，說明急性失血時(shí)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生急劇變化。另外，不同的血液來源（動(dòng)脈血、靜脈血、末梢血等）的血液成分也有很大的差別。劉帥[3]等研究發(fā)現(xiàn)大鼠斷尾采血和眼內(nèi)眥采血的白細(xì)胞極顯著高于腹主動(dòng)脈采血的值。劉斌[4]等發(fā)現(xiàn)大鼠尾靜脈和眼眶靜脈的白細(xì)胞數(shù)值高于腹主動(dòng)脈。這說明不同部位所采集到的血液標(biāo)本所檢測(cè)到白細(xì)胞數(shù)值可能有很大的差異。本實(shí)驗(yàn)中，隨著總血量的減少，采取到的血液的來源也在發(fā)生的變化，這是否是產(chǎn)生白細(xì)胞數(shù)值差異的原因值得進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，大鼠在麻醉狀態(tài)下經(jīng)腹主動(dòng)脈連續(xù)采血時(shí)，白細(xì)胞數(shù)值差異顯著，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行動(dòng)脈連續(xù)采血做不同的分析時(shí)，如同時(shí)采集多管血液分別做血液分析，血生化檢查，凝血指標(biāo)檢查等，需要按照固定的順序采血（如第一管血做血液分析，第二管血做生化分析，第三管血做血凝分析，并且對(duì)于體重相近的動(dòng)物而言，血液分析的采血量也應(yīng)大致相同，以避免誤差。