柯瑩瑩

（茂名市茂南區(qū)高山鎮(zhèn)動物衛(wèi)生監(jiān)督分所，廣東茂名 525011）

1 前言

金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，而且是革蘭氏陽性菌的代表，其在自然界中，廣泛存在于空氣、土壤、水及物品上，特別是人和家畜的體表及外界相通的腔道檢出率相當高[1]。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染[2]；同時金黃色葡萄球菌亦可引起食物中毒，因其在自然界中存在廣泛，食品受到污染的機會很多。金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時，經(jīng)8～10h即可產(chǎn)生相當數(shù)量的腸毒素，導致食物中毒。

慶大霉素屬氨基糖甙類抗生素，其抗菌譜廣，主要作用于細菌的核糖體抑制蛋白的正常合成，使細菌細胞膜通透性增強，導致細胞內鉀離子腺嘌呤核甘酸等重要物質外漏引起細菌死亡。對革蘭氏陰性菌或陽性菌都具良好的抗菌作用，革蘭陽性菌中，金黃色葡萄球菌對該品敏感[3]。

氨芐西林鈉問世于20世紀70年代，氨芐西林鈉是一種為廣譜半合成青霉素類抗生素，作用與青霉素基本相同，但抗菌譜較青霉素為廣，對革蘭陽性球菌作用與青霉素相仿。通過抑制細菌細胞壁合成發(fā)揮抗菌作用，特別是對革蘭氏陽性菌有很好的抗菌效果。

金黃色葡萄球菌是獲得性感染最常見的致病菌之一，隨著抗菌藥物的廣泛應用，尤其是隨著廣譜抗生素的廣泛使用，使金黃色葡萄球菌的耐藥菌株開始不斷出現(xiàn)，且呈多重耐藥性[4]。慶大霉素和氨芐西林鈉對金黃色葡萄球菌均有抗菌作用，通過查詢各種的資料發(fā)現(xiàn)現(xiàn)階段沒有人對慶大霉素、氨芐西林鈉治療金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的耐藥性進行研究。本實驗利用慶大霉素、氨芐西林鈉短期體外誘導金黃色葡萄球菌，了解金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的過程，探討其產(chǎn)生耐藥性的濃度和速度，以便指導臨床金黃色葡萄球菌的治療。

2 實驗材料

2.1 實驗動物

家兔兩只，體重分別為2.1kg和2.3kg。實驗前飼予青草、粉碎后的玉米顆粒。臨床檢查健康后進行實驗，試驗期間自由攝食、飲水。

2.2 實驗菌株

金黃色葡萄球菌凍干粉

2.3 主要試劑、藥品

藥敏實驗試劑盒 杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)2012-07-12生產(chǎn)

營養(yǎng)肉湯 北京陸橋技術有限責任公司，批號110321

營養(yǎng)瓊脂 北京陸橋技術有限責任有限公司2011-10-15生產(chǎn)

革蘭氏染色試劑盒 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司2012-08-21生產(chǎn)

注射用氨芐西林鈉 石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司

硫酸慶大霉素注射液 上海同仁藥業(yè)有限公司上海獸藥廠

2.4 主要儀器、設備

生物顯微鏡（ECLIPSE E200） 日本Nikon公司

微量移液器（WKY） 上海求精生化試劑儀器有限公司

BCM-1000型生物潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠

手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠

一次性注射器（2ml）、培養(yǎng)皿、燒杯、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、容量瓶等。

3 實驗方法

3.1 供試菌液的制備

用接種環(huán)挑取金黃色葡萄球菌放入營養(yǎng)肉湯，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24h，第二天用接種環(huán)蘸取營養(yǎng)肉湯中的菌液在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線培養(yǎng)16～24h，第三天條用接種環(huán)挑取單個菌落并用無菌肉湯稀釋1000倍，用于藥物MIC的測定。另外取菌種在普通瓊脂平板上純培養(yǎng)18h。以上操作均在超凈工作臺無菌的環(huán)境下進行。

3.2 供試藥物最小抑菌濃度（MIC）的測定

分別取無菌帶膠塞試管12支，在超凈工作臺無菌的環(huán)境下，將復壯后的金黃色葡萄球菌菌液用普通營養(yǎng)肉湯稀釋為1×104CFU/ml，第一試管中加入1.8ml的稀釋菌液，其余各管加1.0ml，將氨芐西林鈉、慶大霉素藥液（128ug/ml）分別取0.2ml加入第一管充分混合后，吹打均勻取1.0ml加入第二管，依次類推，直至第11管，混勻后自第11管棄去1ml。第12管不加藥物為空白對照。12個試管內的肉湯中藥物含量分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0ug/ml。稀釋完畢后，塞緊膠塞，置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-18h后查看結果。此試驗每種藥品均重復兩次。

3.3 誘導耐藥性實驗

將實驗菌接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24h，挑取取單個菌落制備1×108CFU/ml細菌懸液，取細菌懸液接種于含藥液的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，使初始濃度為1/4MIC，每次傳代逐步遞增升高藥物的濃度，于37℃培養(yǎng)24h為一代，繼續(xù)進行藥物誘導實驗，當細菌生長抑制時可用同一濃度或降低其濃度再次進行培養(yǎng)。每增加藥物濃度進行藥物誘導實驗的同時接種含耐藥MIC濃度普通營養(yǎng)瓊脂進行同期培養(yǎng)，觀察細菌生長情況，無細菌生長，說明濃度達到最小殺菌濃度。

與此同時，將實驗菌接種于不含藥物的營養(yǎng)肉湯中作為質控菌進行連續(xù)同期培養(yǎng)。

3.4 誘導性耐藥菌株的穩(wěn)定性試驗

將誘導出的高度耐藥的金黃色葡萄球菌菌株接種于無抗菌藥物的普通營養(yǎng)肉湯，于37℃培養(yǎng)每24h轉種培養(yǎng)一代，連續(xù)培養(yǎng)10代。然后采用試管二倍稀釋法測定供試藥物對耐藥供試菌株的MIC。

3.5 耐藥菌的形態(tài)變化觀察

用革蘭氏染色法[5]對金黃色葡萄球菌進行染色、鏡檢，對比觀察各組金黃色葡萄球菌的形態(tài)變化。

3.6 體內耐藥性實驗

健康家兔2只，隨機編號A、B，適應性喂養(yǎng)1周，觀察采食情況。A兔予以腹腔注射經(jīng)誘導的金黃色葡萄球菌菌株1ml，B兔腹腔注射等體積未經(jīng)誘導的金黃色葡萄球菌菌株。并同時分別予以腹腔注射20mg劑量的氨芐西林鈉。腹腔注射后觀察各兔的行為表現(xiàn)，如發(fā)現(xiàn)死亡的家兔即進行剖檢，進行病理學觀察，未死亡兔96h后處死并留取病理標本。

4 結果

4.1 誘導前后各組金黃色葡萄球MIC的測定結果

誘導前金黃色葡萄球菌、同期傳代培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌和誘導后的金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）的詳細對比見表1。

表1 誘導前后各實驗組的MIC

由表1可以看出，金黃色葡萄球菌經(jīng)同期傳代培養(yǎng)后測定MIC，結果與傳代前原株比較無明顯變化；而經(jīng)慶大霉素誘導后的金黃色葡萄球菌與原株比較，耐藥株的MIC增加了8192倍；經(jīng)氨芐西林鈉誘導后的金黃色葡萄球菌與原株比較，耐藥株的MIC則增加了16384倍，誘導后的耐藥株全部為高度耐藥株。

4.2 誘導耐藥性實驗結果

表2 金黃色葡萄球菌藥物誘導過程（d）

續(xù)表2 金黃色葡萄球菌藥物誘導過程（d）

由表2可以看出，未加藥品同期傳代金黃色葡萄球菌進行傳代期間生長均未受抑制，在營養(yǎng)肉湯中生長迅速，管底常有多量白色沉淀。

經(jīng)慶大霉素誘導后的金黃色葡萄球菌，體外誘導耐藥至第13代（4096μg/ml）時細菌的生長開始受到抑制，隨著藥液濃度的升高，在普通肉湯中生長變緩慢；誘導至16代細菌即MIC達到32768μg/ml時金黃色葡萄球菌基本停止生長。

而經(jīng)氨芐西林鈉誘導后的金黃色葡萄球菌于第14代（2048μg/ml）時細菌的生長也開始受到了抑制，隨著藥液濃度的升高，在普通肉湯中生長變得緩慢；體外誘導耐藥至17代即MIC達到16384μg/ml時金黃色葡萄球菌基本停止生長。

4.3 誘導前后金黃色葡萄球菌形態(tài)變化

誘導前金黃色葡萄球菌：于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，金黃色葡萄球菌在瓊脂平板上即形成大量濕潤、光滑、隆起的圓形菌落，菌落顏色呈白色，直徑1～2mm。在營養(yǎng)肉湯中生長迅速，管底有多量白色沉淀，經(jīng)震蕩后沉淀物上升，旋即消散，肉湯即變渾濁。經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，金黃色葡萄球菌呈紫色，菌體圓形，葡萄串狀排列，排列較松散。

誘導后金黃色葡萄球菌：于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，高度耐藥的金黃色葡萄球菌在瓊脂平板上形成少量白色濕潤、光滑、隆起的菌落，菌落顏色呈白色，直徑小于1mm。在普通肉湯中生長緩慢，管底有極少量白色沉淀，輕搖后即消散，肉湯不渾濁。經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，誘導后的金黃色葡萄球菌呈紫色，菌體圓形，葡萄串狀排列，排列致密。

同期傳代培養(yǎng)未經(jīng)誘導的金黃色葡萄球菌：于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，瓊脂平板培養(yǎng)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)和革蘭氏染色鏡檢均與誘導前金黃色葡萄球菌形態(tài)無明顯差異。

4.4 體內耐藥性實驗結果

實驗組A兔腹腔注射高度耐藥金黃色葡萄球菌后4～5d拒食，便軟，不愿動，逐漸消瘦，于第7d死亡。對照組B兔腹腔注射未經(jīng)誘導的金黃色葡萄球菌后未死亡，于第10d人為處死。

剖檢A兔，發(fā)現(xiàn)其凝血不良，心包、胸腔均有積液，心、肺充血嚴重，肺表面有明顯出血性病灶；肝臟體積增大，淤血，色暗紅；腎臟體積輕微增大，色暗紅；腹腔淋巴結腫大。剖檢B兔未發(fā)現(xiàn)異常。

分別取A、B兔心血和脾組織進行涂片，革蘭染色后鏡檢，結果從A兔病理組織中檢出金黃色葡萄球菌；B兔組織中未檢出。

5 討論

慶大霉素和氨芐西林鈉為臨床常用藥，對革蘭氏陽性菌具有一定的抗菌作用。本試驗通過對金黃色葡萄球菌短期內是否會對慶大霉素、氨芐西林鈉產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性進行了探討。

由誘導耐藥性實驗結果可以看出，在氨芐西林鈉、慶大霉素藥物壓力條件下，金黃色葡萄球菌在短期內就能迅速被誘導產(chǎn)生耐藥性，氨芐西林鈉和慶大霉素的MIC分別增加了16384倍和8192倍。且在經(jīng)誘導性耐藥菌株的穩(wěn)定性試驗獲得穩(wěn)定耐藥菌株后，在無藥物壓力的條件下進行細菌培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，誘導后的耐藥金黃色葡萄球菌生長緩慢，倍增時間延長；其與文獻報道[6]結果描述的耐藥菌株的MIC值與其生長速率呈負相關，即細菌獲得的耐藥性越強，生長越緩慢現(xiàn)實相符。通過鏡檢各組金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)原菌株與連續(xù)傳代培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌形態(tài)上并無明顯差異，初步排除了連續(xù)傳代培養(yǎng)對金黃色葡萄球菌可導致耐藥性產(chǎn)生的可能。動物體內耐藥性試驗結果表明了實驗過程中注射正常劑量的藥品對誘導后金黃色葡萄球菌無明顯療效，再一次證明金黃色葡萄球菌經(jīng)誘導后已形成高度耐藥菌。

該研究結果證實了金黃色葡萄球菌可在短期接觸慶大霉素、氨芐西林鈉這兩種抗菌藥物后產(chǎn)生耐藥性變異，形成耐藥菌株。因此，為了限制和減緩金黃色葡萄球菌耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，在臨床抗感染治療中應該遵循抗菌藥物使用原則，合理使用抗菌藥物[7]。為了防止耐藥菌株的產(chǎn)生，應特別注意使用的治療藥物劑量要夠，用藥療程要恰當。不要長期固定使用某一類或某幾種藥物，要有計劃地分期、分批交替使用不同類或不同作用機理的抗菌藥[8]。

此結果對于臨床防治金黃色葡萄球菌感染具有一定的臨床參考價值。

6 結論

經(jīng)過體外誘導金黃色葡萄球菌耐藥試驗，慶大霉素的MIC由4μg/mL增加到32768μg/mL，氨芐西林鈉MIC由1μg/mL增加到16384μg/mL。本試驗證實了用慶大霉素、氨芐西林鈉誘導金黃色葡萄球菌的耐藥性，短期內會使金黃色葡萄球菌產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性，為臨床用慶大霉素、氨芐西林鈉治療金黃色葡萄球菌病提供了一定的理論依據(jù)。