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        紅棕杜鵑(原變種)葉提取物體外抗3種皮膚真菌活性的研究

        2019-08-18 08:18:46楊勇勛
        獸醫(yī)導(dǎo)刊 2019年4期

        莫 全 楊勇勛

        (西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,四川西昌 615000)

        皮膚癬菌病是由皮膚癬菌引起的毛發(fā)、皮膚和指(趾)甲的淺部感染,其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率均較高,并可以在動(dòng)物之間、動(dòng)物與人之間傳播,造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,且部分屬為親動(dòng)物性皮膚癬菌,特別是須毛癬菌、犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌對(duì)犬、貓有重要意義,可引起斑狀脫毛癬、輪狀脫毛癬、水皰性和結(jié)痂性脫毛癬、毛囊炎[1]。臨床上表現(xiàn)極度瘙癢,脫毛形成鱗屑、毛囊破裂、潰瘍性及結(jié)節(jié)性皮炎、指甲干燥開(kāi)裂質(zhì)脆且變形,3種真菌均為人蓄共患病原,人由接觸感染的犬、貓而被傳染,用西藥進(jìn)行治療價(jià)格相對(duì)較貴,并具有一定的毒副作用,臨床上現(xiàn)有的抗真菌藥物如兩性霉素B、唑類抗真菌藥等在高效低毒、抗真菌譜和耐藥性方面評(píng)價(jià)尚不太令人滿意。真菌感染的治療受到藥物安全性、真菌耐藥性及藥物效能等方面的局限[2],因此急需研發(fā)有效的、安全無(wú)毒的、純天然的、對(duì)環(huán)境友好的植物源抑真菌劑替代化學(xué)藥劑,有利于治愈各種頑固性真菌疾病。

        杜鵑花(Rhododendron simsii Planch),又稱山躑躅、山石榴、映山紅,全世界的杜鵑花約有900種,中國(guó)杜鵑花種類多、分布廣,四川涼山地區(qū)杜鵑花科植物種類多,分布范圍廣,物種資源豐富,且涼山紅棕杜鵑(原變種)還具有一些其他中醫(yī)藥不具備的獨(dú)特功能,部分種類還為特殊種[3]。目前對(duì)于杜鵑花的研究主要集中于止咳、平喘、治療慢性支氣管等疾病,據(jù)資料記載杜鵑花毒素具祛風(fēng)除濕,降低血壓,減慢心率的功效[4],對(duì)于紅棕杜鵑(原變種)對(duì)皮膚真菌的治療暫無(wú)記錄,屬于研究的空白。從植物與微生物中研究新的生物天然抗真菌物質(zhì)是當(dāng)前開(kāi)發(fā)、研制新型殺菌劑的熱點(diǎn)之一,現(xiàn)階段有關(guān)植物提取物對(duì)抗皮膚真菌的研究不多,但植物仍被認(rèn)為是化學(xué)藥劑最好的替代品,Wilkins等(1989)曾報(bào)道有1389種植物有可能作為殺菌劑[5],植物中的抗毒素、類黃酮、有機(jī)酸以及酚類化合物均具有殺菌或抗菌活性,而杜鵑花(原變種)中富含黃酮等酚酸類成分,因此將紅棕杜鵑(原變種)提取物作用于皮膚真菌的研究與開(kāi)發(fā)具有很高的價(jià)值。

        1 材料

        1.1 試驗(yàn)菌種

        犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌三種皮膚真菌,由西昌學(xué)院攀西動(dòng)物疫病檢測(cè)與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.2 材料與試劑

        紅棕杜鵑(原變種)葉2016年6月采集于涼山州昭覺(jué)縣七里壩,經(jīng)西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院楊勇勛副教授鑒定。葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、蒸餾水、正丁醇、二甲基亞砜、石蠟,以上藥品均由西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

        2 方法

        2.1 藥物制備

        2.1.1 紅棕杜鵑(原變種)葉各提取物的制備

        將采集的涼山紅棕杜鵑(原變種)葉1kg,用清水沖洗兩遍并用蒸餾水沖洗兩遍,自然條件下通風(fēng)干燥后,用電動(dòng)粉碎機(jī)粉碎成粉末,室溫下用95%的乙醇、乙酸乙酯、石油醚分別浸泡兩次,每次約24h,浸泡完成后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑,分別得到乙醇、乙酸乙酯、石油醚浸劑提取物,各取20g提取物標(biāo)記備用[6]。

        2.1.2 紅棕杜鵑(原變種)葉乙醇提取物各萃取相的制備

        乙醇提取物除部分直接用于活性測(cè)定外,余者全部混懸于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按3比1的比例進(jìn)行萃取。萃取液分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器后,分別得到石油醚相浸膏、乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏,各取20g浸膏標(biāo)記備用[7]。

        2.1.3 紅棕杜鵑(原變種)葉各提取物及乙醇提取物各萃取相溶液的配制

        取紅棕杜鵑(原變種)葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液及乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相浸膏各2g,然后用水及適量的二甲基亞砜配制成濃度為1g/L的藥液,做好標(biāo)記供生物活性測(cè)定時(shí)使用。

        2.2 抗菌活性試驗(yàn)

        準(zhǔn)確吸取1.5ml藥液加入到13.5ml融化的沙氏培養(yǎng)基中(50℃左右),混勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿(直徑9.0cm)內(nèi),制成含藥培養(yǎng)基平板,不同含藥培養(yǎng)基平板做好標(biāo)記,對(duì)照混入相同體積的二甲基亞砜與水混合物加入到13.5ml融化的沙氏培養(yǎng)基,混合均勻后倒入規(guī)格一致的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi),制成不含藥培養(yǎng)基平板,作為空白對(duì)照組[8-9]。在已培養(yǎng)4~5d的供試菌平板上,用直徑為0.4cm的打孔器制成若干菌餅,用接種環(huán)挑取菌餅分別輕放于含藥培養(yǎng)基和非含藥培養(yǎng)基平面上(有菌絲的一面朝下),每個(gè)培養(yǎng)皿放置兩個(gè)菌餅,每組重復(fù)3次,25℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周后測(cè)定各試驗(yàn)組的菌落直徑。

        2.3 計(jì)算紅棕杜鵑(原變種)葉提取物抑菌率

        按下式計(jì)算紅棕杜鵑(原變種)葉提取物對(duì)供試菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率。

        2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

        采用SPSS 20. 0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,并進(jìn)行單因素方差分析和多重比較,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 紅棕杜鵑(原變種)葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液抗3種皮膚真菌活性結(jié)果

        從表1可以明顯看出不同極性的有機(jī)溶劑所得杜鵑(原變種)葉粗提液對(duì)3種皮膚真菌均有抑制作用,且抑制效果差別明顯,乙酸乙酯粗提液抑菌效果最佳,對(duì)石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌和須毛癬菌抑菌率分別為43.3%、49.3%、53.6%,石油醚粗提液抑菌效果最差,對(duì)抑菌率分別為28.3%、29.6%、32.4%。

        表1 紅棕杜鵑(原變種)葉乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液抑菌率

        3.2 紅棕杜鵑(原變種)葉乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相抗3種皮膚真菌活性結(jié)果

        從表2可以觀察出紅棕杜鵑(原變種)葉各萃取相對(duì)3種皮膚真菌均有不同程度的抑制作用,對(duì)犬小孢子菌來(lái)說(shuō),乙酸乙酯萃取相抑菌效果最佳,抑菌率為42%,正丁醇萃取相抑菌效果最弱,抑菌率為18.5%。

        表2 紅棕杜鵑(原變種)葉乙酸乙酯萃取相、石油醚萃取相、正丁醇萃取相抑菌率

        以上結(jié)果表明紅棕杜鵑(原變種)葉提取物對(duì)于3種皮膚真菌均有抑制作用,經(jīng)95%乙醇浸泡后正丁醇萃取所得的粗提液抑菌效果最差,乙酸乙酯粗提取液抑菌效果最佳,根據(jù)相似相溶的原理,紅棕杜鵑(原變種)葉的抗真菌成分主要存在于乙酸乙酯當(dāng)中。

        4 結(jié)果與討論

        皮膚癬菌可分為親動(dòng)物型與親人型,均可直接或間接引起人的皮膚癬菌病,潮濕、溫暖、不潔、擁擠的環(huán)境是造成皮膚癬菌病的主要因素,皮膚癬菌病呈世界性分布,且對(duì)動(dòng)物特別是犬、貓皮膚造成了重要傷害[10-12]。植物源藥物由于不易產(chǎn)生耐藥,是當(dāng)前抗菌藥物研究的熱點(diǎn),現(xiàn)階段對(duì)于通過(guò)植物源藥物治療皮膚真菌的記錄逐年增加,如科學(xué)家已通過(guò)提取洋蔥、竹、大蒜、大蔥、韭菜及若干種中藥中的有效成分作用于皮膚真菌,且研究結(jié)果表明有抑制作用[13]。目前杜鵑(原變種)葉的研究前景主要集中于扦插繁育方面,關(guān)于治療皮膚真菌暫無(wú)記錄。植物粗提取物成分復(fù)雜,通過(guò)不同的提取方法、提取溶劑可得到不同的有效成分,藥理作用復(fù)雜,抗真菌成分也多樣,并且受各種因素影響,因此對(duì)于植物源藥物的開(kāi)發(fā)與研究需要深入且系統(tǒng)地研究[14]。

        本試驗(yàn)用不同極性的紅棕杜鵑(原變種)葉提取物及萃取相對(duì)犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌三種皮膚癬菌進(jìn)行體外抗真菌活性的研究,試驗(yàn)結(jié)果顯示紅棕杜鵑(原變種)葉具有抑菌作用,在同一種有機(jī)溶劑中,浸泡所得粗提液抑菌效果優(yōu)于萃取相;同種提取方法中,乙酸乙酯粗提取液效果較好,乙醇粗提取液效果次之,石油醚粗提取液效果最弱。楊勇勛等人從紅棕杜鵑(原變種)乙酸乙酯粗提液中分離純化得到的植物單體─東莨菪內(nèi)酯[15],研究表明該單體主要存在于紅棕杜鵑(原變種)當(dāng)中,具有良好的殺蟲(chóng)、抗菌殺菌、殺螨、化感等生物活性[16],這與本次試驗(yàn)當(dāng)中乙酸乙酯粗提液抗皮膚真菌效果最佳的結(jié)果相一致,且提示試驗(yàn)中主要的抗真菌成分可能為東莨菪內(nèi)酯,說(shuō)明從紅棕杜鵑(原變種)中提取抗真菌活性藥物具有研究?jī)r(jià)值。此次試驗(yàn)結(jié)果為植物源抗菌藥物的研發(fā)提供了一定的參考價(jià)值,但杜鵑(原變種)葉中具有抗真菌作用的具體成分是什么,何種提取溶劑何種提取方法所得提取物的何種濃度的抑菌效果最佳,還需要進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用。

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