童 威 謝冬根 樂 俊 廖 愷

(鷹潭市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，鷹潭335000)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤，其發(fā)病率占顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的一半以上,其5年預(yù)后生存率僅為20%～30%[1]。目前臨床上常規(guī)的手術(shù)、放療、化療及聯(lián)合治療的預(yù)后均不佳。因此，從分子生物學(xué)角度研究膠質(zhì)瘤的病理機(jī)制，可為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新靶點(diǎn)。

DNA結(jié)合蛋白果蠅Eph激酶(Drosophila Eph kinase，DEK)為一種普遍存在的可磷酸化的染色質(zhì)構(gòu)架蛋白，已被確認(rèn)為癌基因，其過表達(dá)參與癌基因的突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2,3]。研究表明DEK蛋白與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移，且DEK主要在增殖活躍的細(xì)胞和癌細(xì)胞中高表達(dá)[4,5]。大量研究證實(shí)，DEK在多種腫瘤中，如乳腺癌、肝癌、宮頸癌、食管癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均高表達(dá)[6-12]。但DEK在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制尚未完全清楚。

NF-κB信號(hào)通路是細(xì)胞周期調(diào)控的途徑之一，通過縮短真核細(xì)胞分裂G1期的時(shí)相，加快細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖，而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-15]。NF-κB通路在神經(jīng)細(xì)胞中促凋亡基因有Bax、P53、Fas/Fasl、Bcl-Xs、Bad和Bak，抑凋亡基因有Bcl-2、P63、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 1，TRAF1)、TRAF2、應(yīng)激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、 細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡域樣白介素-1β轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白(Cellular Fas-associated death domain-like interleukin-1β converting enzyme-like inhibitory protein,c-FLIP)和即刻早期反應(yīng)X-1L(Immediate early response X-1L,IEX-1L)等[16]。已有研究證實(shí)，NF-κB信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成生長中也發(fā)揮重要作用，其活性的增加與不良預(yù)后呈正相關(guān)[17-20]。因此，抑制NF-κB途徑已成為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的方案之一。而神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NF-κB的上游相關(guān)調(diào)控因子尚未明確。

本研究通過檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中DEK的表達(dá)，觀察過表達(dá)DEK和沉默DEK對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和NF-κB信號(hào)通路的影響，闡明DEK抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡可能與激活NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，這將為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向治療提供新靶點(diǎn)和研究方向。

1 材料與方法

1.1材料 人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞SVG p12、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87和U118均購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連Takara公司；p65抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、GADPH、pcDNA 3.1-DEK和載體pcDNA 3.1均購于北京中杉公司；Control siRNA序列F 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′，R 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′，DEK RT-PCR序列F 5′-CAGGCACTGTGTCCTCAT-3′，R 5′-CATTTGGTTCGCTTAGCCT-3′ 均由上海吉瑪公司合成；PVDF膜購于德國羅氏診斷有限公司；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購于碧云天生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京萊寶公司；流式細(xì)胞儀購自美國 FALS CALIBAR BD公司；凝膠成像分析儀購自柯達(dá)公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司；紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司；PCR 儀購自美國BIO-RAD公司。12只SPF裸鼠(18～20 g)購自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)生物有限公司，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)制度對動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SVGp12、U87和U118細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代后，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2轉(zhuǎn)染 將Control siRNA、si-DEK、pcDNA 3.1-DEK和pcDNA 3.1用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞，分別標(biāo)記為Control siRNA組、DEK-siRNA組、pcDNA 3.1-DEK組和Scrambled組。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對數(shù)生長期進(jìn)行Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)、Western blot和Annexin V-FITC/PI雙染色實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR 取適量對數(shù)生長期細(xì)胞，Trizol法裂解細(xì)胞，RNA抽提試劑盒提取RNA,并進(jìn)行定量。然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,qRT-PCR試劑盒進(jìn)行DEK的檢測，以2-ΔΔCt法計(jì)算定量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，RIPA裂解后用BCA進(jìn)行定量，然后100℃沸水中變性10 min，離心后取上清進(jìn)行蛋白上樣。按照Western blot實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作流程進(jìn)行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-顯影曝光。Image J分析目的條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)情況。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡 取適量對數(shù)生長期細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 次。用結(jié)合緩沖液 500 μl懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl的 Annexin V-FITC和PI，混勻，室溫避光靜置15 min。細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞儀分析測定。細(xì)胞的總凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.6裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 把SPF裸鼠分為Control siRNA組、DEK siRNA組、Scrambled組、pc-DNA 3.1-DEK組，每組3只。用1 ml注射器分別吸取0.2 ml、濃度為1×106個(gè)/ml的轉(zhuǎn)染上述siRNA或質(zhì)粒的U87細(xì)胞，碘伏消毒后，裸鼠右前肢接種腫瘤，SPF環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)。接種后每隔5 d，固定時(shí)間用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長直徑a(mm)和最短直徑b(mm)，腫瘤體積V=a×b2×0.52計(jì)算腫瘤體積(mm3)。約第30天，裸鼠皮下形成較大腫瘤，斷頸法處死裸鼠，取出皮下腫瘤組織，稱量瘤體重量。

2 結(jié)果

2.1DEK在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá) 運(yùn)用qRT-PCR檢測SVGp12、U87和U118細(xì)胞中DEK mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1A所示，與SVGp12細(xì)胞相比，U87和U118細(xì)胞中DEK mRNA的表達(dá)水平顯著升高。用Western blot檢測SVGp12、U87和U118中DEK的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1B、C所示，與SVGp12細(xì)胞相比，U87和U118細(xì)胞中DEK蛋白表達(dá)顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢姡珼EK在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)。

2.2沉默DEK促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡 如圖2A所示，與Control siRNA組相比，DEK siRNA組細(xì)胞DEK mRNA的相對表達(dá)顯著降低。Western blot 檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2B、C所示，DEK siRNA組細(xì)胞DEK蛋白表達(dá)較Control siRNA組顯著降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖2D、E所示，DEK siRNA組細(xì)胞凋亡率相比于Control siRNA組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢?，沉默DEK促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

2.3沉默DEK抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長 DEK siRNA組裸鼠成瘤在第20、25、30天相比于Control siRNA組，腫瘤的體積均顯著減小(圖3A)；DEK siRNA組裸鼠成瘤第30天時(shí)相比于Control siRNA組，腫瘤的重量顯著降低(圖3B)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。可見，沉默DEK抑制裸鼠成瘤的生長。

2.4沉默DEK抑制NF-κB信號(hào)通路表達(dá) 如圖4A、B所示，DEK siRNA組細(xì)胞相比于Control siRNA組，p65蛋白表達(dá)顯著降低，p-p65蛋白表達(dá)

圖1 DEK在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)Fig.1 High expresstion DEK in glioma cellsNote: A.DEK mRNA expression in SVGp12，U87 and U118 cell line;B,C.Protein expression of DEK in SVGp12，U87 and U118 cell line.*.P<0.05 vs SVGp12 cell.

圖2 沉默DEK促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡Fig.2 Silencing DEK promotes cell apoptosis in gliomacellsNote: A.The effect of silencing DEK on the expression of DEK mRNA in U87 cells;B,C.The effect of silencing DEK on the protein expression of DEK in U87 cells;D,E.The effect of silencing DEK on cell apoptosis rate in U87 cells.*.P<0.05 vs Control siRNA.

變化無顯著差異；如圖4C、D所示，DEK siRNA組細(xì)胞相比于Control siRNA組，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢?，沉默DEK抑制NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)。

2.5過表達(dá)DEK抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡 如圖5A所示，與Scrambled組細(xì)胞相比，pcDNA 3.1-DEK組細(xì)胞DEK mRNA的表達(dá)顯著升高；Western blot 檢測DEK的蛋白表達(dá)，如圖5B、C所示，pcDNA 3.1-DEK組細(xì)胞DEK的蛋白表達(dá)顯著高于Scrambled組。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖5D、E所示，pcDNA 3.1-DEK組細(xì)胞凋亡率較Scrambled組顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢姡^表達(dá)DEK抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

2.6過表達(dá)DEK促進(jìn)裸鼠成瘤生長 pcDNA 3.1-DEK組裸鼠成瘤相比于Scrambled組，在第20、25、30天腫瘤的體積顯著增加(圖6A)，并且pcDNA3.1-DEK組裸鼠成瘤第30天時(shí)的腫瘤重量顯著升高(圖6B)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢?，過表達(dá)DEK促進(jìn)裸鼠成瘤生長。

圖3 沉默DEK抑制裸鼠成瘤的生長Fig.3 Silencing DEK inhibits tumor growth in nude miceNote: A.The effect of silencing DEK on tumor size in nude mice at different times;B.The effect of silencing DEK on tumor weight in nude mice.*.P<0.05 vs Control siRNA.

圖4 沉默DEK抑制NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)Fig.4 Silencing DEK inhibits expression of NF-κB signaling pathwayNote: A，B.The effect of silencing DEK on the protein expression of p65 and p-p65 in glioma cells;C，D.The effect of silencing DEK on the protein expression of Bcl-2 and Bax.*.P<0.05 vs Control siRNA.

圖5 過表達(dá)DEK抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡Fig.5 Overexpression of DEK inhibits cell apoptosis in glioma cellsNote: A.The effect of pcDNA3.1-DEK on expression of DEK mRNA in glioma cells;B，C.The effect of pcDNA3.1-DEK on the protein expression of DEK in glioma cells;D，E.The effect of pcDNA3.1-DEK on the cell apoptosis in glioma cells.*.P<0.05 vs Scrambled.

圖6 過表達(dá)DEK促進(jìn)裸鼠成瘤生長Fig.6 Overexpression of DEK promotes tumor growth in nude miceNote: A.The effect of pcDNA3.1-DEK on tumor size in nude mice at different times;B.The effect of pcDNA3.1-DEK on tumor weight in nude mice.*.P<0.05 vs Scrambled.

圖7 過表達(dá)DEK激活NF-κB信號(hào)通路Fig.7 Overexpression of DEK activates NF-κB signal-ing pathwayNote: A，B.The effect of pcDNA3.1-DEK on the protein expression of p65 and p-p65 in glioma cells;C，D.The effect of pcDNA3.1-DEK on the protein expression of Bcl-2 and Bax in glioma cells.*.P<0.05 vs Scrambled.

2.7過表達(dá)DEK 激活NF-κB信號(hào)通路 如圖7A、B所示，與Scrambled組細(xì)胞相比，pcDNA 3.1-DEK組細(xì)胞p65蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，Bax的蛋白表達(dá)顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。可見，過表達(dá)DEK激活NF-κB信號(hào)通路。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是對人類身體健康造成重大威脅的一類疾病，其發(fā)病與病毒感染、頭部外傷、放射照射、化學(xué)物質(zhì)、內(nèi)分泌和代謝紊亂等因素有關(guān)[21]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展主要涉及3條基因信號(hào)通路，分別為P53/MEM2/P21/P12途徑、Rb-E2F/CDK4,6/P16-cyclinD途徑和EGFR/PTEN/PI3K途徑[22]。而神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向治療主要依賴分子遺傳學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)，本研究將從DEK和NF-κB通路研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的相關(guān)機(jī)制。DEK蛋白是一種原癌蛋白，人類DEK蛋白是由375個(gè)氨基酸組成，附有4個(gè)不同的酸性氨基酸伸展區(qū)域，其通過干擾細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)及抑制細(xì)胞分化、衰老和凋亡發(fā)揮生物功能，并通過影響P53和Ki-67等多種基因的表達(dá)而參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[23-26]。目前已有研究證實(shí)，DEK蛋白在良性腫瘤中低表達(dá)或不表達(dá)，在惡性腫瘤中高表達(dá)，推測抑制惡性腫瘤中DEK的表達(dá)可能為腫瘤治療提供新方向[27,28]。李偉偉等[29]在肝癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，沉默DEK抑制肝癌細(xì)胞增殖并改變細(xì)胞周期分布，其機(jī)制可能與下調(diào)CyclinD1表達(dá)有關(guān)。Feng等[11]在星形細(xì)胞瘤的研究中證實(shí)，DEK的表達(dá)水平與星形膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)呈正相關(guān)，且沉默DEK可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖，誘導(dǎo)P53途徑的細(xì)胞中凋亡。本研究通過檢測人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U118中DEK的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，DEK在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，通過Western blot、流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)DEK和沉默DEK的U87細(xì)胞中凋亡蛋白、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)DEK抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，激活NF-κB信號(hào)通路，沉默DEK可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，失活NF-κB信號(hào)通路；進(jìn)一步運(yùn)用裸鼠成瘤術(shù)驗(yàn)證，過表達(dá)DEK促進(jìn)腫瘤生長，沉默DEK可抑制腫瘤生長。這更充分地驗(yàn)證了前人的研究結(jié)果，DEK在膠質(zhì)瘤中為高表達(dá)的促癌因子。

NF-κB的主要成員有NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、Re 1A(p65)、RelB和RelC五種亞基，僅有p65在蛋白的C末端含有轉(zhuǎn)錄激活域，能直接作用并激活轉(zhuǎn)錄過程[30]。NF-κB抗凋亡、促細(xì)胞增殖和免疫激活的功能是導(dǎo)致正常細(xì)胞惡變的潛在因素[31]。NF-κB在腫瘤細(xì)胞中有明確的抗凋亡作用，抑制NF-κB的表達(dá)可增加腫瘤壞死因子引起的細(xì)胞凋亡，及增加腫瘤細(xì)胞對放療、化療的敏感性[32]。Meffert等[33]首次發(fā)現(xiàn)NF-κB在神經(jīng)元中存在，后來研究證實(shí)，在大腦皮層海馬神經(jīng)元內(nèi)、突觸膠質(zhì)細(xì)胞等均存在NF-κB。在動(dòng)物模型和人類疾病的研究中，已證實(shí)NF-κB在許多疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，其在很多相關(guān)疾病的靶向治療中效果均較明顯。張俊志等[34]在膠質(zhì)瘤中NF-κB和Survivin的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，NF-κB過表達(dá)可通過上調(diào)Survivin的表達(dá)并抑制星形細(xì)胞瘤的凋亡，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮作用。最近，張瑩等[35]通過對感染J亞群禽白血病病毒的雞成纖維細(xì)胞DF-1的細(xì)胞活性、env基因表達(dá)量、p27抗原水平、NF-κB活性及NF-κB p60、p65蛋白表達(dá)檢測得到，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可通過失活NF-κB信號(hào)通路提高DF-1細(xì)胞對J亞群禽白血病病毒的抵抗力。本研究通過檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中NF-κB信號(hào)關(guān)鍵蛋白p65、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，DEK可調(diào)控NF-κB信號(hào)通路。

總之，沉默DEK可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤生長，其機(jī)制可能與失活NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，這將為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向治療提供依據(jù)。