亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        間質(zhì)性肺病小鼠外周血循環(huán)纖維細(xì)胞的變化及依那西普的干預(yù)作用①

        2019-08-16 09:04:10王慧選殷寒秋殷松樓
        中國免疫學(xué)雜志 2019年12期
        關(guān)鍵詞:那西普羥脯氨酸纖維細(xì)胞

        王慧選 殷寒秋 辜 沖 殷松樓

        (徐州醫(yī)科大學(xué),徐州221000)

        間質(zhì)性肺病(Interstitial lung disease,ILD)是一類主要累及肺泡腔和肺間質(zhì),以不同程度的肺泡炎癥和肺纖維化為病理特征的肺部疾病。約1/3的ILD患者繼發(fā)于結(jié)締組織疾病(Connective tissue disease,CTD),ILD常導(dǎo)致肺功能降低和生活質(zhì)量下降,5年生存率僅為20%,缺乏有效的治療方法[1]。已知肺成纖維細(xì)胞在ILD病理發(fā)生發(fā)展中有重要作用,循環(huán)纖維細(xì)胞(Circulating fibrocytes)是肺成纖維細(xì)胞的重要來源之一,可能參與了ILD的病理過程[2]。TNF-α是ILD發(fā)病的重要細(xì)胞因子,TNF-α拮抗劑依那西普在治療結(jié)締組織疾病中取得了較好的效果,但是,目前TNF-α拮抗劑對于結(jié)締組織疾病相關(guān)性間質(zhì)性肺病(CTD-ILD)的治療效果尚存在較大爭議[3,4]。本實(shí)驗(yàn)觀察在BLM誘導(dǎo)小鼠ILD的病理進(jìn)程中的循環(huán)纖維細(xì)胞的數(shù)量變化,以及依那西普對ILD的干預(yù)效果及對循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量的影響。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 9~11周齡SPF級雌性昆明小鼠60只購于徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,重量(20±0.93)g。飼養(yǎng)在室溫、相對濕度為(55±10)%的環(huán)境中,自主攝食和飲水。

        1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 博來霉素針劑為日本化藥株式會社生產(chǎn),15 mg/支;依那西普為三生國健藥業(yè)(上海)股份有限公司生產(chǎn),12.5 mg/支;固定與透膜試劑盒、Percp標(biāo)記抗小鼠 CD45 購自BD公司;兔抗小鼠ColⅠ抗體購自Rockland 公司;FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自上海貝博生物;兔抗小鼠α-SMA抗體購自艾博拉(上海)貿(mào)易有限公司;生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒和DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; Masson染色試劑盒和羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所;流式細(xì)胞儀為BD LSRFortessaTMCell Analyzer。

        1.2方法

        1.2.1分組與模型建立 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組:模型組(A組,n=20)、依那西普干預(yù)組(B組,n=20)、生理鹽水對照組(C組,n=20)。

        適應(yīng)性飼養(yǎng)后,小鼠腹腔注射濃度為0.3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg),麻醉后切開頸部逐層分離組織至氣管。A組和B組用1 ml注射器吸取藥量為5.0 mg/kg的BLM 溶液,緩慢滴入氣管,滴入過程中將小鼠直立,使BLM溶液在肺內(nèi)分布均勻,同時觀察小鼠呼吸情況,進(jìn)行創(chuàng)口縫合。C組小鼠經(jīng)氣管注入等體積的生理鹽水。BLM給藥24 h,B組皮下注射依那西普(0.4 mg/kg,2次/周),A組和C組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液,藥物干預(yù)至小鼠處死前24 h。

        1.2.2循環(huán)纖維細(xì)胞檢測 3組小鼠均在BLM 給藥后第7、14、21、28天時眼球取血法分別處死5只,取200 μl肝素鈉抗凝血于流式管中,CD45單抗 25 ml(0.02 mg/ml),渦旋器振蕩混勻,室溫避光孵育15 min;離心機(jī)500 g離心5 min后,加入固定透膜液500 μl(1∶1),4℃孵20 min;每管加透膜洗滌液1 ml(1∶10),500 g/min 離心5 min,棄上清,重復(fù)上述操作1次;每管加兔抗小鼠Col Ⅰ 抗體2 μl(0.01 mg/ml),4℃避光孵育30 min,洗滌2次;每管加FITC 標(biāo)記的山羊抗兔抗體27 μl(0.04 mg/ml)于管底,4℃避光孵育30 min,洗滌2次后,最后以300 μl PBS緩沖液重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測,每管獲取1×105個細(xì)胞,原始數(shù)據(jù)采用FloJo-V10軟件處理。

        1.2.3肺組織炎癥、纖維化程度的病理學(xué)分析 小鼠右肺組織經(jīng)4%多聚甲醛通用型組織固定液固定、脫水、石蠟包埋后,石蠟切片機(jī)制作3 μm的石蠟切片,常規(guī)HE染色及按照Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。觀察肺組織炎癥改變和肺組織膠原沉積情況。肺部炎癥評分:0分為無炎癥細(xì)胞;1分為少量炎癥細(xì)胞;2分為輕度炎癥;3分為中度炎癥;4分為重度炎癥。肺部纖維化評分采用Ashcroft半定量法[5],0分:正常肺組織;1分:肺泡或細(xì)支氣管壁輕微纖維增厚;3分:細(xì)支氣管壁或肺泡壁增厚,肺泡結(jié)構(gòu)無明顯破壞;5分:纖維化程度增加,肺泡結(jié)構(gòu)受到一定程度破壞,有纖維束或小纖維團(tuán)形成;7分:嚴(yán)重的肺泡結(jié)構(gòu)破壞,大面積纖維化;8分:肺幾乎完全纖維化(2、4、6 分為上述各級的過渡階段)。

        1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測肺組織α-SMA 表達(dá)情況 石蠟切片脫蠟至水,熱修復(fù)5~10 min,重復(fù)2~3次;PBS緩沖液洗滌3次,每次5 min;之后步驟按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。

        1.2.5肺組織羥脯氨酸測定 取小鼠左肺組織,取合適重量按照羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行操作,分光光度儀檢測羥脯氨酸含量。

        2 結(jié)果

        2.1肺組織病理學(xué)改變 HE染色顯示,A組第7天時肺間隔增寬且有大量炎癥細(xì)胞浸潤;第14天時肺部組織基本消失,肺泡結(jié)構(gòu)幾乎不可見;第21天時肺部斑片化;第28天時斑片面積減少,病理情況減輕。與A組同時期相比,B組病理情況輕于A組(圖1)。Masson染色顯示,A組第7天開始出現(xiàn)少量膠原纖維沉積,到第14天達(dá)到最高峰,隨后逐漸減少。B組各時期的膠原纖維沉積程度較A組輕(圖2)。

        2.2肺部炎癥及纖維化評分 根據(jù)肺部炎癥分級和Ashcroft半定量法評分,結(jié)果顯示A組炎癥評分在第7、14、21天時較C組高(P<0.01),B組炎癥評分在第14天和第21天較A組低(P<0.01),B組炎癥評分僅在第14天時較C組高(P<0.01)。A組纖維化評分較各個時期的C組高(P<0.01),B組纖維化評分在第14、21和28天較A組低(P<0.01),B組纖維化評分較各個時期的C組高(P<0.01)(表1、表2)。

        2.3羥脯氨酸含量 A組在各個時期的羥脯氨酸含量顯著高于C組(P<0.01),B組羥脯氨酸含量在第7、14、21天時低于A組(P<0.05),B組在各個時期的羥脯氨酸含量高于C組(P<0.01)(表3)。

        圖1 A組、B組和C組小鼠肺組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of lung tissue in mice of groups A,B and C (×200)

        2.4外周血循環(huán)纖維細(xì)胞百分比 A組循環(huán)纖維細(xì)胞百分比第7天達(dá)到最高(5.86±1.98)%,隨后呈下降趨勢;A組循環(huán)纖維細(xì)胞百分比在第7、14、21天時顯著高于C組(P<0.01),B組循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)目在第7、14、21天時低于A組(P<0.01),B組循環(huán)纖維細(xì)胞百分比在第7、14天時高于C組(P<0.01)(圖3)。

        2.5肺組織α-SMA的表達(dá)情況 A組和B組免疫組化結(jié)果顯示除了支氣管和血管管壁表達(dá)α-SMA外,在肺組織實(shí)變處新出現(xiàn)了表達(dá)α-SMA的肌纖維母細(xì)胞。A組第7天出現(xiàn)α-SMA表達(dá),至第14天達(dá)到最高;B組在第14、21天α-SMA表達(dá)量均少于A組;C組在各個時期除了支氣管和血管管壁外,沒有出現(xiàn)α-SMA表達(dá)情況(圖4)。

        圖2 A組、B組和C組小鼠肺組織的Masson染色(×200)Fig.2 Masson′s staining of lungs in mice of groups A,B and C (×200)

        ItemDay 7Day 14Day 21Day 28Group A2.80±0.572)3.60±0.421)2)2.60±0.421)2)1.50±0.79Group B1.80±0.762.00±0.613)1.00±0.620.80±0.27Group C0.90±0.420.70±0.270.30±0.270.30±0.27

        Note:1)Group A vs Group B,P<0.01;2)Group A vs Group C,P<0.01;3)Group B vs Group C,P<0.01.

        ItemDay 7Day 14Day 21Day 28Group A3.00±0.622)3.80±0.571)2)4.20±0.571)2)3.20±0.571)2)Group B2.30±0.453)2.20±0.763)2.60±0.653)1.60±0.423)Group C0.80±0.270.50±0.350.20±0.270.10±0.22

        Note:1)Group A vs Group B,P<0.01;2)Group A vs Group C,P<0.01;3)Group B vs Group C,P<0.01.

        ItemDay 7Day 14Day 21Day 28Group A0.71±0.071)2)0.82±0.101)2)0.72±0.111)2)0.61±0.092)Group B0.52±0.043)0.61±0.093)0.53±0.083)0.46±0.053)Group C0.35±0.050.36±0.020.35±0.040.34±0.03

        Note:1)Group A vs Group B,P<0.05,2)Group A vs Group C,P<0.01,3)Group B vs Group C,P<0.01.

        圖3 A組、B組和C組小鼠外周血循環(huán)纖維細(xì)胞趨勢圖和柱狀圖Fig.3 Trend chart and histogram of peripheral blood circulating fibrocytes in mice of groups A,B and CNote: *.P<0.01.

        圖4 A組、B組和C組小鼠肺組織α-SMA表達(dá)情況(×200)Fig.4 Expression of α-SMA in mice in groups A,B and C (×200)

        圖5 循環(huán)纖維細(xì)胞百分比與肺組織炎癥評分、纖維化評分和羥脯氨酸含量的相關(guān)性Fig.5 Correlation of percentage of circulating fibrocytes with lung inflammation score,fibrosis score and hydroxyproline content

        2.6循環(huán)纖維細(xì)胞百分比與肺組織炎癥和纖維化評分、羥脯氨酸的相關(guān)性分析 Spearman分析結(jié)果顯示,A組和B組小鼠外周血循環(huán)纖維細(xì)胞百分比與肺組織炎癥評分、纖維化評分和羥脯氨酸含量呈正相關(guān)(r=0.540,0.384,0.535;n=40,P<0.05)(圖5)。

        3 討論

        ILD發(fā)病率呈逐年上升趨勢,預(yù)后差,缺乏有效的治療措施。為了提供新的診斷和治療方法,本實(shí)驗(yàn)通過BLM誘導(dǎo)的小鼠ILD模型,初步探討ILD的發(fā)病機(jī)制和依那西普對ILD的治療作用。ILD的特征是不同程度的炎癥和纖維化,是CTD的常見并發(fā)癥,肺泡炎癥導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞異常損傷修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,病理改變的最終結(jié)局是不可逆的肺纖維化,成纖維細(xì)胞在ILD進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,而循環(huán)纖維細(xì)胞是肺成纖維細(xì)胞的重要來源之一,因此減少成纖維細(xì)胞的來源至關(guān)重要。

        Hashimoto等[6]在BLM誘導(dǎo)長期移植表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的肺損傷模型中,發(fā)現(xiàn)肺部表達(dá)膠原的細(xì)胞很大比例是骨髓來源的外周循環(huán)纖維細(xì)胞。循環(huán)纖維細(xì)胞從外周血遷移至肺部,增殖分化為肌纖維母細(xì)胞,肌纖維母細(xì)胞除了表達(dá)成纖維的部分標(biāo)志外還特異性表達(dá)α-SMA[7]。肺組織免疫組化顯示,循環(huán)纖維細(xì)胞在損傷部位特異性地分化為肌纖維母細(xì)胞并參與損傷組織的修復(fù),且特異性表達(dá)α-SMA。循環(huán)纖維細(xì)胞同時具有血源性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的功能和特征,標(biāo)志物CD45和ColⅠ雙陽性常用來鑒別循環(huán)纖維細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為肺部炎癥、纖維化評分和羥脯氨酸含量與循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān),外周血循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量變化與BLM誘導(dǎo)的小鼠ILD病理進(jìn)展一致,提示其參與該ILD模型的炎癥和纖維化過程。

        臨床上常采用糖皮質(zhì)激素或糖皮質(zhì)激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺的用藥方案治療CTD-ILD,但常需要監(jiān)測其毒副作用。最新口服藥物尼達(dá)尼布(nintedanib)和吡非尼酮(pirfenidone),在特發(fā)性肺纖維化的治療上有一定效果[8,9],但僅能延緩肺功能下降速度,并不能從根本上阻止和逆轉(zhuǎn)肺纖維化的進(jìn)程,并且其在CTD-ILD的療效尚不清楚,因此尚需一種安全可靠的治療方案。

        腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是在廣泛的炎性和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用的促炎介質(zhì),它是宿主對抗感染和炎癥反應(yīng)的一個重要組成部分。TNF-α促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖,增加成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和促進(jìn)膠原纖維合成[10]。在CTD的發(fā)病機(jī)制中,TNF-α活動的失調(diào)是重要原因之一。近年來TNF-α抑制劑在CTD-ILD治療上取得了一定效果,但偶爾有加重ILD的案例報道[4],因此需要更多研究來證實(shí)其效果。

        依那西普是臨床最常用的TNF-α抑制劑之一,它是一種二聚體融合蛋白,結(jié)構(gòu)包含TNF-αⅡ型受體(TNF-RⅡ)的細(xì)胞外配體p75和人免疫球蛋白IgG的Fc部分。依那西普與TNF-α有更強(qiáng)、更特異的結(jié)合作用,對TNF-α的親和力是單體TNF-RⅡ蛋白的1 000倍,半衰期是單體TNF-RⅡ蛋白的5倍,半衰期為70~100 h。依那西普通過競爭性阻斷TNF-α與天然配體p55的結(jié)合,達(dá)到抑制TNF-α的目的[11]。本實(shí)驗(yàn)通過依那西普對間質(zhì)性肺病小鼠進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示依那西普可以減輕BLM誘導(dǎo)的ILD小鼠的肺部炎癥及纖維化癥狀,同時減少循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量,提示減少循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量可能是依那西普作用ILD的環(huán)節(jié)之一。

        綜上所述,循環(huán)纖維細(xì)胞可能參與BLM誘導(dǎo)小鼠ILD的病理進(jìn)程,這為ILD的治療和監(jiān)測提供新的方法和思路;依那西普抑制循環(huán)纖維細(xì)胞的數(shù)量,減輕小鼠ILD的炎癥和纖維化程度,為依那西普臨床應(yīng)用提供理論支持,但是依那西普抑制循環(huán)纖維細(xì)胞的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

        猜你喜歡
        那西普羥脯氨酸纖維細(xì)胞
        高效液相色譜法測定紡織品中的羥脯氨酸含量
        依那西普治療嬰兒川崎病致重癥皮疹1例
        Tiger17促進(jìn)口腔黏膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移
        滇南小耳豬膽道成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定
        TNF-α拮抗劑依那西普治療強(qiáng)直性脊柱炎的研究進(jìn)展
        α-酮戊二酸對L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響
        中國釀造(2018年7期)2018-08-10 02:16:48
        高效液相色譜法檢測醬油中羥脯氨酸的含量研究
        歐盟建議批準(zhǔn)首個依那西普仿制藥上市
        健康管理(2015年12期)2016-01-14 18:57:19
        胃癌組織中成纖維細(xì)胞生長因子19和成纖維細(xì)胞生長因子受體4的表達(dá)及臨床意義
        兩種制備大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的方法比較
        日韩精品一区二区三区在线观看的| 精品高朝久久久久9999| 日本大肚子孕妇交xxx| 狠狠色综合7777久夜色撩人| 亚洲尺码电影av久久| 亚洲AV小说在线观看| 日韩精品免费av一区二区三区 | 国产精品无码翘臀在线观看| 国产性生大片免费观看性| 国产99久久亚洲综合精品| 国产目拍亚洲精品一区二区| 日韩国产自拍视频在线观看 | 亚洲国产精品成人久久久| 伊伊人成亚洲综合人网香| 色狠狠色狠狠综合一区| 中文字幕人成乱码中文乱码| 东北熟妇露脸25分钟| 国内精品视频在线播放不卡| 中日av乱码一区二区三区乱码 | 国产麻豆剧传媒精品国产av| 人妻少妇精品中文字幕专区| 污污内射在线观看一区二区少妇 | 99久久国产亚洲综合精品| 国产91久久精品成人看网站| 五月天中文字幕日韩在线| 亚洲av一二三区成人影片| 亚洲色大成网站www永久一区| 欧美亚洲国产丝袜在线| 国产一区二区av免费观看| 欧美性受xxxx狂喷水| 亚州精品无码人妻久久| 亚洲视频在线播放免费视频| 在线观看国产成人自拍视频| 天堂资源中文最新版在线一区| 白浆出来无码视频在线| 手机av男人天堂免费网址| 免费亚洲老熟熟女熟女熟女| 精品国产三级a∨在线| 人妻丰满熟妇AV无码区HD| 日韩女同一区在线观看| 69国产成人精品午夜福中文|