王慧選 殷寒秋 辜 沖 殷松樓

(徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州221000)

間質(zhì)性肺病(Interstitial lung disease,ILD)是一類主要累及肺泡腔和肺間質(zhì)，以不同程度的肺泡炎癥和肺纖維化為病理特征的肺部疾病。約1/3的ILD患者繼發(fā)于結(jié)締組織疾病(Connective tissue disease，CTD)，ILD常導(dǎo)致肺功能降低和生活質(zhì)量下降，5年生存率僅為20%，缺乏有效的治療方法[1]。已知肺成纖維細(xì)胞在ILD病理發(fā)生發(fā)展中有重要作用，循環(huán)纖維細(xì)胞(Circulating fibrocytes)是肺成纖維細(xì)胞的重要來源之一，可能參與了ILD的病理過程[2]。TNF-α是ILD發(fā)病的重要細(xì)胞因子，TNF-α拮抗劑依那西普在治療結(jié)締組織疾病中取得了較好的效果，但是，目前TNF-α拮抗劑對于結(jié)締組織疾病相關(guān)性間質(zhì)性肺病(CTD-ILD)的治療效果尚存在較大爭議[3,4]。本實(shí)驗(yàn)觀察在BLM誘導(dǎo)小鼠ILD的病理進(jìn)程中的循環(huán)纖維細(xì)胞的數(shù)量變化，以及依那西普對ILD的干預(yù)效果及對循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 9～11周齡SPF級雌性昆明小鼠60只購于徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，重量(20±0.93)g。飼養(yǎng)在室溫、相對濕度為(55±10)%的環(huán)境中,自主攝食和飲水。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 博來霉素針劑為日本化藥株式會社生產(chǎn)，15 mg/支；依那西普為三生國健藥業(yè)(上海)股份有限公司生產(chǎn)，12.5 mg/支；固定與透膜試劑盒、Percp標(biāo)記抗小鼠 CD45 購自BD公司；兔抗小鼠ColⅠ抗體購自Rockland 公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自上海貝博生物；兔抗小鼠α-SMA抗體購自艾博拉(上海)貿(mào)易有限公司；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒和DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司； Masson染色試劑盒和羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所；流式細(xì)胞儀為BD LSRFortessaTMCell Analyzer。

1.2方法

1.2.1分組與模型建立 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組：模型組(A組,n=20)、依那西普干預(yù)組(B組,n=20)、生理鹽水對照組(C組,n=20)。

適應(yīng)性飼養(yǎng)后，小鼠腹腔注射濃度為0.3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)，麻醉后切開頸部逐層分離組織至氣管。A組和B組用1 ml注射器吸取藥量為5.0 mg/kg的BLM 溶液，緩慢滴入氣管，滴入過程中將小鼠直立，使BLM溶液在肺內(nèi)分布均勻，同時觀察小鼠呼吸情況，進(jìn)行創(chuàng)口縫合。C組小鼠經(jīng)氣管注入等體積的生理鹽水。BLM給藥24 h，B組皮下注射依那西普(0.4 mg/kg,2次/周)，A組和C組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，藥物干預(yù)至小鼠處死前24 h。

1.2.2循環(huán)纖維細(xì)胞檢測 3組小鼠均在BLM 給藥后第7、14、21、28天時眼球取血法分別處死5只，取200 μl肝素鈉抗凝血于流式管中，CD45單抗 25 ml(0.02 mg/ml),渦旋器振蕩混勻，室溫避光孵育15 min；離心機(jī)500 g離心5 min后，加入固定透膜液500 μl(1∶1)，4℃孵20 min；每管加透膜洗滌液1 ml(1∶10)，500 g/min 離心5 min，棄上清，重復(fù)上述操作1次；每管加兔抗小鼠Col Ⅰ 抗體2 μl(0.01 mg/ml)，4℃避光孵育30 min，洗滌2次；每管加FITC 標(biāo)記的山羊抗兔抗體27 μl(0.04 mg/ml)于管底，4℃避光孵育30 min，洗滌2次后，最后以300 μl PBS緩沖液重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測，每管獲取1×105個細(xì)胞,原始數(shù)據(jù)采用FloJo-V10軟件處理。

1.2.3肺組織炎癥、纖維化程度的病理學(xué)分析 小鼠右肺組織經(jīng)4%多聚甲醛通用型組織固定液固定、脫水、石蠟包埋后，石蠟切片機(jī)制作3 μm的石蠟切片，常規(guī)HE染色及按照Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。觀察肺組織炎癥改變和肺組織膠原沉積情況。肺部炎癥評分：0分為無炎癥細(xì)胞；1分為少量炎癥細(xì)胞；2分為輕度炎癥；3分為中度炎癥；4分為重度炎癥。肺部纖維化評分采用Ashcroft半定量法[5]，0分：正常肺組織；1分：肺泡或細(xì)支氣管壁輕微纖維增厚；3分：細(xì)支氣管壁或肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)無明顯破壞；5分：纖維化程度增加，肺泡結(jié)構(gòu)受到一定程度破壞，有纖維束或小纖維團(tuán)形成；7分：嚴(yán)重的肺泡結(jié)構(gòu)破壞，大面積纖維化；8分：肺幾乎完全纖維化(2、4、6 分為上述各級的過渡階段)。

1.2.4免疫組織化學(xué)法檢測肺組織α-SMA 表達(dá)情況 石蠟切片脫蠟至水,熱修復(fù)5～10 min，重復(fù)2～3次；PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min；之后步驟按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5肺組織羥脯氨酸測定 取小鼠左肺組織，取合適重量按照羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行操作，分光光度儀檢測羥脯氨酸含量。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理學(xué)改變 HE染色顯示，A組第7天時肺間隔增寬且有大量炎癥細(xì)胞浸潤；第14天時肺部組織基本消失，肺泡結(jié)構(gòu)幾乎不可見；第21天時肺部斑片化；第28天時斑片面積減少，病理情況減輕。與A組同時期相比，B組病理情況輕于A組(圖1)。Masson染色顯示，A組第7天開始出現(xiàn)少量膠原纖維沉積，到第14天達(dá)到最高峰，隨后逐漸減少。B組各時期的膠原纖維沉積程度較A組輕(圖2)。

2.2肺部炎癥及纖維化評分 根據(jù)肺部炎癥分級和Ashcroft半定量法評分，結(jié)果顯示A組炎癥評分在第7、14、21天時較C組高(P<0.01)，B組炎癥評分在第14天和第21天較A組低(P<0.01)，B組炎癥評分僅在第14天時較C組高(P<0.01)。A組纖維化評分較各個時期的C組高(P<0.01)，B組纖維化評分在第14、21和28天較A組低(P<0.01)，B組纖維化評分較各個時期的C組高(P<0.01)(表1、表2)。

2.3羥脯氨酸含量 A組在各個時期的羥脯氨酸含量顯著高于C組(P<0.01)，B組羥脯氨酸含量在第7、14、21天時低于A組(P<0.05)，B組在各個時期的羥脯氨酸含量高于C組(P<0.01)(表3)。

圖1 A組、B組和C組小鼠肺組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of lung tissue in mice of groups A,B and C (×200)

2.4外周血循環(huán)纖維細(xì)胞百分比 A組循環(huán)纖維細(xì)胞百分比第7天達(dá)到最高(5.86±1.98)%，隨后呈下降趨勢；A組循環(huán)纖維細(xì)胞百分比在第7、14、21天時顯著高于C組(P<0.01)，B組循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)目在第7、14、21天時低于A組(P<0.01)，B組循環(huán)纖維細(xì)胞百分比在第7、14天時高于C組(P<0.01)(圖3)。

2.5肺組織α-SMA的表達(dá)情況 A組和B組免疫組化結(jié)果顯示除了支氣管和血管管壁表達(dá)α-SMA外，在肺組織實(shí)變處新出現(xiàn)了表達(dá)α-SMA的肌纖維母細(xì)胞。A組第7天出現(xiàn)α-SMA表達(dá)，至第14天達(dá)到最高；B組在第14、21天α-SMA表達(dá)量均少于A組；C組在各個時期除了支氣管和血管管壁外，沒有出現(xiàn)α-SMA表達(dá)情況(圖4)。

圖2 A組、B組和C組小鼠肺組織的Masson染色(×200)Fig.2 Masson′s staining of lungs in mice of groups A,B and C (×200)

ItemDay 7Day 14Day 21Day 28Group A2.80±0.572)3.60±0.421)2)2.60±0.421)2)1.50±0.79Group B1.80±0.762.00±0.613)1.00±0.620.80±0.27Group C0.90±0.420.70±0.270.30±0.270.30±0.27

Note：1)Group A vs Group B,P<0.01；2)Group A vs Group C,P<0.01;3)Group B vs Group C,P<0.01.

ItemDay 7Day 14Day 21Day 28Group A3.00±0.622)3.80±0.571)2)4.20±0.571)2)3.20±0.571)2)Group B2.30±0.453)2.20±0.763)2.60±0.653)1.60±0.423)Group C0.80±0.270.50±0.350.20±0.270.10±0.22

Note：1)Group A vs Group B,P<0.01；2)Group A vs Group C,P<0.01；3)Group B vs Group C,P<0.01.

ItemDay 7Day 14Day 21Day 28Group A0.71±0.071)2)0.82±0.101)2)0.72±0.111)2)0.61±0.092)Group B0.52±0.043)0.61±0.093)0.53±0.083)0.46±0.053)Group C0.35±0.050.36±0.020.35±0.040.34±0.03

Note：1)Group A vs Group B,P<0.05,2)Group A vs Group C,P<0.01,3)Group B vs Group C,P<0.01.

圖3 A組、B組和C組小鼠外周血循環(huán)纖維細(xì)胞趨勢圖和柱狀圖Fig.3 Trend chart and histogram of peripheral blood circulating fibrocytes in mice of groups A,B and CNote: *.P<0.01.

圖4 A組、B組和C組小鼠肺組織α-SMA表達(dá)情況(×200)Fig.4 Expression of α-SMA in mice in groups A,B and C (×200)

圖5 循環(huán)纖維細(xì)胞百分比與肺組織炎癥評分、纖維化評分和羥脯氨酸含量的相關(guān)性Fig.5 Correlation of percentage of circulating fibrocytes with lung inflammation score,fibrosis score and hydroxyproline content

2.6循環(huán)纖維細(xì)胞百分比與肺組織炎癥和纖維化評分、羥脯氨酸的相關(guān)性分析 Spearman分析結(jié)果顯示，A組和B組小鼠外周血循環(huán)纖維細(xì)胞百分比與肺組織炎癥評分、纖維化評分和羥脯氨酸含量呈正相關(guān)(r=0.540,0.384,0.535；n=40,P<0.05)(圖5)。

3 討論

ILD發(fā)病率呈逐年上升趨勢，預(yù)后差，缺乏有效的治療措施。為了提供新的診斷和治療方法，本實(shí)驗(yàn)通過BLM誘導(dǎo)的小鼠ILD模型，初步探討ILD的發(fā)病機(jī)制和依那西普對ILD的治療作用。ILD的特征是不同程度的炎癥和纖維化，是CTD的常見并發(fā)癥，肺泡炎癥導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞異常損傷修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，病理改變的最終結(jié)局是不可逆的肺纖維化，成纖維細(xì)胞在ILD進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，而循環(huán)纖維細(xì)胞是肺成纖維細(xì)胞的重要來源之一，因此減少成纖維細(xì)胞的來源至關(guān)重要。

Hashimoto等[6]在BLM誘導(dǎo)長期移植表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的肺損傷模型中,發(fā)現(xiàn)肺部表達(dá)膠原的細(xì)胞很大比例是骨髓來源的外周循環(huán)纖維細(xì)胞。循環(huán)纖維細(xì)胞從外周血遷移至肺部，增殖分化為肌纖維母細(xì)胞，肌纖維母細(xì)胞除了表達(dá)成纖維的部分標(biāo)志外還特異性表達(dá)α-SMA[7]。肺組織免疫組化顯示，循環(huán)纖維細(xì)胞在損傷部位特異性地分化為肌纖維母細(xì)胞并參與損傷組織的修復(fù)，且特異性表達(dá)α-SMA。循環(huán)纖維細(xì)胞同時具有血源性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的功能和特征，標(biāo)志物CD45和ColⅠ雙陽性常用來鑒別循環(huán)纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為肺部炎癥、纖維化評分和羥脯氨酸含量與循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，外周血循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量變化與BLM誘導(dǎo)的小鼠ILD病理進(jìn)展一致，提示其參與該ILD模型的炎癥和纖維化過程。

臨床上常采用糖皮質(zhì)激素或糖皮質(zhì)激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺的用藥方案治療CTD-ILD，但常需要監(jiān)測其毒副作用。最新口服藥物尼達(dá)尼布(nintedanib)和吡非尼酮(pirfenidone)，在特發(fā)性肺纖維化的治療上有一定效果[8,9]，但僅能延緩肺功能下降速度，并不能從根本上阻止和逆轉(zhuǎn)肺纖維化的進(jìn)程，并且其在CTD-ILD的療效尚不清楚，因此尚需一種安全可靠的治療方案。

腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是在廣泛的炎性和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用的促炎介質(zhì)，它是宿主對抗感染和炎癥反應(yīng)的一個重要組成部分。TNF-α促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，增加成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和促進(jìn)膠原纖維合成[10]。在CTD的發(fā)病機(jī)制中，TNF-α活動的失調(diào)是重要原因之一。近年來TNF-α抑制劑在CTD-ILD治療上取得了一定效果，但偶爾有加重ILD的案例報道[4]，因此需要更多研究來證實(shí)其效果。

依那西普是臨床最常用的TNF-α抑制劑之一，它是一種二聚體融合蛋白，結(jié)構(gòu)包含TNF-αⅡ型受體(TNF-RⅡ)的細(xì)胞外配體p75和人免疫球蛋白IgG的Fc部分。依那西普與TNF-α有更強(qiáng)、更特異的結(jié)合作用，對TNF-α的親和力是單體TNF-RⅡ蛋白的1 000倍，半衰期是單體TNF-RⅡ蛋白的5倍，半衰期為70～100 h。依那西普通過競爭性阻斷TNF-α與天然配體p55的結(jié)合，達(dá)到抑制TNF-α的目的[11]。本實(shí)驗(yàn)通過依那西普對間質(zhì)性肺病小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示依那西普可以減輕BLM誘導(dǎo)的ILD小鼠的肺部炎癥及纖維化癥狀，同時減少循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量，提示減少循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)量可能是依那西普作用ILD的環(huán)節(jié)之一。

綜上所述，循環(huán)纖維細(xì)胞可能參與BLM誘導(dǎo)小鼠ILD的病理進(jìn)程，這為ILD的治療和監(jiān)測提供新的方法和思路；依那西普抑制循環(huán)纖維細(xì)胞的數(shù)量，減輕小鼠ILD的炎癥和纖維化程度，為依那西普臨床應(yīng)用提供理論支持，但是依那西普抑制循環(huán)纖維細(xì)胞的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。