李姚，王健

年齡相關(guān)性黃斑變性 (age-related macular degeneration，AMD)屬于視網(wǎng)膜退行性疾病，該病病理學(xué)發(fā)生基礎(chǔ)為視網(wǎng)膜色素上皮 (retina pigment epithelium，RPE)細(xì)胞[1]。RPE 細(xì)胞為單層柱狀細(xì)胞，容易受到周圍環(huán)境影響，RPE細(xì)胞損傷后可引起光感受器變性、視網(wǎng)膜變薄[2]。藏紅花素（Crocin）是從藏紅花植物莖中提取的單體化合物，具有抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用[3]。已有學(xué)者將其應(yīng)用于眼部，發(fā)現(xiàn)藏紅花素能提高視網(wǎng)膜抗氧化能力、抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、改善視網(wǎng)膜微循環(huán)的作用[4]。本文擬通過(guò)采用體外高氧條件下培養(yǎng)RPE細(xì)胞，初步探討藏紅花素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPE細(xì)胞 (美國(guó)ATCC公司)，藏紅花素(美國(guó)Sigma 公司，純度>99%)，二甲基亞砜、H2O2（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，杭州四季青公司)、MTT試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，Annexin-V/PI試劑盒及H2DCFDA熒光探針 (美國(guó)BD公司)，Bcl-2及Bax抗體（上海碧云天公司）。

1.2 RPE細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RPE細(xì)胞培養(yǎng) 將RPE細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，每3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

RPE細(xì)胞分組 細(xì)胞接種于96孔板中，共分4組，每組5個(gè)復(fù)孔。（1）對(duì)照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。（2）氧化損傷組：培養(yǎng)液內(nèi) H2O2濃度為 300 μmol·L-1。（3）藏紅花素組：加入藏紅花素作用 24 h之后，加入300 μmol·L-1H2O2溶液作用 12 h，依藏紅花素濃度不同分為 2 個(gè)亞組 (10 μmol·L-1及 100 μmol·L-1)。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖

RPE細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200 μL，細(xì)胞密度為1×104個(gè)/L，向各孔細(xì)胞中加入10 μLMTT(5 g·L-1)，4 h 后吸出上清液， 加入 100 μL DMSO溶液，輕微振蕩10 min后測(cè)定各孔570 nm的光密度值（OD）。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD）×100%。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RPE細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）表達(dá)

RPE細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，0.1%胰酶 （不含EDTA）消化各組細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液。1000 r/min離心后收集細(xì)胞，加入5 μL H2DCFDA染料后置于暗室內(nèi)避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量變化。

1.5 Annexin V/PI流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

0.1%胰酶（不含EDTA）消化各組細(xì)胞后制備細(xì)胞懸液。1000 r/min離心后收集細(xì)胞，分別加入5 μL Annexin-V 和10 μL PI染料后充分混勻避光反應(yīng)15 min，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 Western blot法檢測(cè)RPE細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9的蛋白表達(dá)

提取蛋白質(zhì)后上樣，電泳，聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉12 h，加入相應(yīng)抗體，ECL化學(xué)發(fā)光法自顯影，用Bio-Rad Quantity One軟件分析電泳結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，各處理組組間比較采用兩因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度藏紅花素對(duì)RPE細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示（表1），對(duì)照組RPE細(xì)胞存活率為98.33%±4.90%，氧化損傷組RPE細(xì)胞存活率為43.12%±3.39%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=48.08，P<0.05），不同濃度藏紅花素干預(yù)后，RPE細(xì)胞存活率分別提高到61.76%±4.76%和77.67%±4.43%，與氧化損傷組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F低=40.89，F(xiàn)高=90.33，均 P<0.05）。

表1 MTT法檢測(cè)藏紅花素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞存活率的影響（

表1 MTT法檢測(cè)藏紅花素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞存活率的影響（

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與氧化損傷組比較，P<0.05

?

2.2 RPE細(xì)胞內(nèi)ROS改變

流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，氧化損傷組RPE細(xì)胞內(nèi)DCF熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，表明細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重，不同濃度藏紅花素干預(yù)后，DCF熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱，表明藏紅花素抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS生成，改變了RPE細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)（圖1）。

2.3 藏紅花素抑制H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組（4.33%±2.50%）比較，氧化損傷組RPE細(xì)胞凋亡率明顯升高（F=89.02，P<0.05），隨著藏紅花素作用濃度的遞增，H2O2誘導(dǎo)的 RPE 細(xì)胞凋亡率呈劑量（10 μmol·L-1及 100 μmol·L-1）依賴性遞減（39.00%±3.77%、18.00%±3.80%），與氧化損傷組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F低=192.40，F(xiàn)高=95.76，均 P<0.05）。 （表 2、圖 2）

2.4 藏紅花素抑制H2O2誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組相比，H2O2抑制RPE細(xì)胞中抗信號(hào)分子Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)RPE細(xì)胞中促凋亡信號(hào)分子Bax的表達(dá)。經(jīng)過(guò)藏紅花素處理后，Bcl-2的表達(dá)升高，Bax 的表達(dá)下降（圖 3、圖 4）。

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)RPE細(xì)胞內(nèi)ROS改變。1A 對(duì)照組；1B 氧化損傷組；1C 藏紅花素低濃度組；1D 藏紅花素高濃度組

圖2 藏紅花素對(duì)H2O2誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡影響。2A 對(duì)照組；2B 氧化損傷組；2C 藏紅花素低濃度組；2D 藏紅花素高濃度組

3 討論

視網(wǎng)膜特別容易受到氧化損傷影響，高濃度的多不飽和脂肪酸、持續(xù)的光照及密集的氧代謝產(chǎn)物促進(jìn)了視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成[5]。體外補(bǔ)充抗氧化劑來(lái)維持視網(wǎng)膜的功能不失為一種防治視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷的有效方法。藏紅花素分子式為C44H64O24，分子量為977.21 kD，抗氧化作用明顯?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藏紅花素具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能、降低胰島素抵抗、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、治療慢性胃病、預(yù)防心血管疾病發(fā)生的功效[6-7]。近年來(lái)，一些學(xué)者將藏紅花素應(yīng)用于體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，均顯示了藏紅花素有效的清除羥自由基、超氧自由基及抗凋亡作用。郭斌[4]發(fā)現(xiàn)藏紅花素通過(guò)抑制糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的表達(dá)，保護(hù)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞。呂伯昌[8]認(rèn)為藏紅花素能有效抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與影響Ca2+內(nèi)流有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，我們使用 300 μmol·L-1H2O2建立了RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，觀查藏紅花素對(duì)RPE細(xì)胞的保護(hù)作用。 結(jié)果顯示，300 μmol·L-1H2O2引起RPE 細(xì)胞活力降低，10 μmol·L-1及 100 μmol·L-1藏紅花素作用于RPE細(xì)胞后，RPE細(xì)胞增殖率隨藏紅花素濃度的升高而升高，證實(shí)了藏紅花素對(duì)RPE的保護(hù)作用。

圖3 藏紅花素對(duì)RPE細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Bax表達(dá)的影響（電泳圖）

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藏紅花素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡率的影響（

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藏紅花素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡率的影響（

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與氧化損傷組比較，P<0.05

?

圖4 藏紅花素對(duì)RPE細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Bax表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激在AMD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，H2O2生成的ROS導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和上皮細(xì)胞損傷，與AMD發(fā)生機(jī)制相似[9-10]。本實(shí)驗(yàn)中，我們使用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS生成量及細(xì)胞凋亡率，結(jié)果表明，H2O2促進(jìn)了RPE細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和細(xì)胞凋亡，藏紅花素可以劑量依賴性的RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

Bcl-2及Bax均屬于細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡信號(hào)通路中的信號(hào)分子。其中，Bcl-2為抗凋亡蛋白，通過(guò)阻止細(xì)胞色素C的釋放抑制凋亡；Bax為促凋亡蛋白，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放促進(jìn)凋亡[11]。Western blot結(jié)果顯示，H2O2抑制RPE細(xì)胞中抗信號(hào)分子Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)凋亡信號(hào)分子Bax的表達(dá)，經(jīng)過(guò)藏紅花素處理后，Bcl-2的表達(dá)升高，Bax的表達(dá)下降，進(jìn)一步說(shuō)明藏紅花素能夠有效抑制H2O2誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡。

總之，本研究初步證實(shí)藏紅花素對(duì)氧化應(yīng)激環(huán)境下RPE細(xì)胞的保護(hù)作用，為今后預(yù)防和治療視網(wǎng)膜退行性疾病提供了一定方向。