黃小慶 徐云森 吳江平 嚴(yán)文兵 高榮芳 郭宇明 招活 蘇勁松

(廣州市中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510130)

睪丸生精功能障礙是導(dǎo)致男性不育的主要原因，臨床表現(xiàn)為少精、弱精甚至無(wú)精。西醫(yī)對(duì)不育癥的治療一般采用對(duì)因?qū)ΠY治療，如激素替代治療、抗生素治療、精索靜脈曲張及隱睪癥的手術(shù)治療等；此外，輔助生殖技術(shù)是近年來(lái)治療不育癥的熱點(diǎn)，尤其是卵細(xì)胞內(nèi)精子注射(intracytoplasmic spermatozoo injection，ICSI)被認(rèn)為是男子不育癥治療上的一次革命[1]，但是，其診療費(fèi)用高，使絕大多數(shù)不育患者難以承擔(dān)。中醫(yī)學(xué)對(duì)男性不育的認(rèn)識(shí)已有兩千多年的歷史，在治療上具有獨(dú)到之處，療效較好，患者易于接受。因此，探求中醫(yī)藥治療，從體內(nèi)改善精子質(zhì)量，使一部分患者通過(guò)簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)而恰當(dāng)?shù)姆椒ń鉀Q生育問(wèn)題不失為一有效途徑。本研究采用我院臨床應(yīng)用多年、主治男性不育癥的有效經(jīng)驗(yàn)方—溫腎丸，擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究方法，探討其對(duì)腎陽(yáng)虛生精障礙大鼠治療作用的藥效學(xué)機(jī)制，為挖掘和發(fā)揮中醫(yī)藥治療優(yōu)勢(shì)病種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠(成年雄性，SPF級(jí)別，體質(zhì)量180～210 g)，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)[許可證號(hào)：SCXK(粵)20160041]，大鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。藥物與試劑：溫腎丸為濃縮水丸，由廣州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供(生產(chǎn)批號(hào)：粵藥制字Z06022722)；克羅米芬(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)1325021)；腺嘌呤(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)E1814057)； 抑制素B(INHB)、睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為： Y9DTQ7USGC，GGCIBVX15T，PKTV3QZEH2，7DU612VNTK)。儀器：生物組織智能脫水機(jī)(湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司，ART-12B)；顯微鏡(OLYMPUS CORPORATION，CKX41SF)；切片機(jī)[萊卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司，RM2016]；生物組織攤烤片機(jī)(湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司，ATK-7)；生物組織石蠟包埋機(jī)(湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司，ABM-6L)；離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司，JW3021H)；酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司，AMR-100)。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 60只SD雄性大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只；單純模型組10只；陽(yáng)性對(duì)照組(克羅米芬組)10只；溫腎丸低、中、高劑量組各10只。除空白對(duì)照組外 ，其余各組動(dòng)物按腺嘌呤200 mg/(k g·d)體質(zhì)量灌胃10 d制備腎陽(yáng)虛模型。造模結(jié)束后開始給藥，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物按低、中、高劑量組分別給予溫腎丸混懸液50 mg(kg·d)、100 mg(k g·d)、200 mg/(k g·d)體質(zhì)量灌胃，連續(xù)30 d；陽(yáng)性對(duì)照組用克羅米芬混懸液13.5 mg/(kg·d)體質(zhì)量灌胃，連續(xù)30 d。所有動(dòng)物均予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水?？瞻讓?duì)照組和單純模型組灌服等容量生理鹽水，其他條件相同。實(shí)驗(yàn)期間仔細(xì)觀察并記錄各組大鼠的表現(xiàn)，如精神體態(tài)、毛色情況、活動(dòng)反應(yīng)、進(jìn)食、飲水與大便情況等。大鼠每周稱重1次，以調(diào)整給藥劑量。

1.2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠于末次給藥1 h后，采用異氟烷進(jìn)行麻醉，用眼眶采血法收集血液2～3 mL于抗凝管中，將其編號(hào)，靜置1 h后，抽取血液放入離心管中離心，轉(zhuǎn)速為3 000 rpm，5 min，留取血清按說(shuō)明書進(jìn)行操作檢測(cè)血清T、FSH、LH、INHB含量，酶標(biāo)儀檢測(cè)460 nm的OD值。同時(shí)獲取雙側(cè)睪丸，將睪丸樣本置于固定液中固定10～12 h。固定后的樣本經(jīng)常規(guī)梯度酒精(80%、90%、100%)脫水，二甲苯I(無(wú)水乙醇∶二甲苯=1∶1 )浸泡2h后二甲苯Ⅱ和Ⅲ分別處理10 min、5 min進(jìn)行透明。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋，冷卻凝固成塊。連續(xù)切成厚度5 μm的薄片，每隔30張取蠟帶放到加熱的水中燙平，分別貼于涂有蛋白甘油(用于HE染色)的載玻片上，置于45 ℃恒溫箱中烘干備用。石蠟切片HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)觀察及Johnson評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般情況觀察 空白組，發(fā)育較快，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏、活動(dòng)正常，毛發(fā)光滑澤潤(rùn)。模型組大鼠喜暖怕冷、倦縮拱背、毛無(wú)光澤且散亂、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，形體消瘦，生長(zhǎng)緩慢。溫腎丸各劑量組和克羅米芬組造模10 d后開始干預(yù)，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，與單純模型組比較上述癥狀逐漸減輕，給藥30 d后，溫腎丸組一般狀態(tài)改善較為明顯。除模型組大鼠死亡2只外，其余各組均無(wú)死亡。

2.2 睪丸組織病理觀察及 Johnsen評(píng)分 各組病理活檢顯示，空白組(圖A)大鼠生精小管基膜完整，輪廓清晰，生精細(xì)胞層次豐富，管腔處有大量精子細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞分布均勻；模型組(圖B)大鼠生精小管基膜塌陷，變性，生精細(xì)胞層次模糊不清，排列稀疏，大量細(xì)胞脫落與細(xì)胞碎片擁堵管腔，管腔內(nèi)精子細(xì)胞缺失，間質(zhì)細(xì)胞聚集成團(tuán)；克羅米芬組(圖C)大鼠生精小管基膜欠完整，生精細(xì)胞層次模糊不清晰，管腔生精細(xì)胞稀疏，間質(zhì)細(xì)胞聚集分布；溫腎丸低劑量組(圖D)大鼠生精小管基膜欠完整，生精細(xì)胞排列稀疏，管腔內(nèi)精子數(shù)量較少，間質(zhì)細(xì)胞聚集分布；溫腎丸中、高劑量組(圖E、圖F)大鼠生精小管基膜較完整，輪廓較清晰，生精細(xì)胞層次較多，管腔內(nèi)精子細(xì)胞較多，間質(zhì)細(xì)胞散在分布。各組大鼠睪丸活檢Johnson 評(píng)分比較見表1。

A：空白組；B模型組；C克羅米芬組；D溫腎丸低劑量組；E溫腎丸中劑量組；F溫腎丸高劑量組

圖1 各組大鼠高倍鏡下生精小管形態(tài)

表1 各組大鼠睪丸活檢Johnson 評(píng)分比較

注：與模型組相比，*P<0.01，與溫腎丸低劑量組、克羅米芬對(duì)照組相比，△P<0.01。

2.3 各組大鼠血清T、FSH、LH、INHB含量比較 模型組各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)均有變化，其中T和INHB減少，F(xiàn)SH、LH升高，與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。溫腎丸各劑量組和克羅米芬組治療后大鼠血清T、INHB上升，F(xiàn)SH、LH降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中溫腎丸高、中劑量組與低劑量組和克羅米芬組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清T、FSH、LH、INHB比較含量

注：與模型組相比，*P<0.01，與溫腎丸低劑量組、克羅米芬組相比，△P<0.01。

3 討 論

男性不育癥中醫(yī)統(tǒng)屬 “精少無(wú)子”、“精清”、“精冷”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為腎藏精主生長(zhǎng)發(fā)育與生殖，本病主要責(zé)之于腎，若腎陽(yáng)虛損，溫煦生化功能失職，或腎陰不足，精氣化生乏源以及虛火內(nèi)灼津液，可導(dǎo)致精少清冷，精弱無(wú)力而造成不育。雖然不育癥的病因病機(jī)變化多端，治療方法多種多樣，但“補(bǔ)腎”仍是中醫(yī)藥治療男性不育的重要方法。

腎陽(yáng)虛所致的男性不育在中醫(yī)男科的研究中一直是備受重視的課題。腎陽(yáng)虛作為中醫(yī)學(xué)的概念，是指腎陽(yáng)為一身陽(yáng)氣之根本，它對(duì)體內(nèi)各個(gè)臟腑起著溫煦生化的作用，若腎陽(yáng)虛損，溫煦功能失職，則可導(dǎo)致虛寒衰弱諸癥及生殖機(jī)能的減退。

腎陽(yáng)虛模型的制作方法較多，有糖皮質(zhì)激素注射法、腺嘌呤灌喂法、 鎖陽(yáng)水灌注法等。糖皮質(zhì)激素造模是應(yīng)用較廣泛的造模方法，該模型主要通過(guò)影響下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能，導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)激適應(yīng)能力下降，動(dòng)物的生命活動(dòng)減弱、畏寒喜暖等表現(xiàn)與腎陽(yáng)虛的表現(xiàn)一致[2]，但此法對(duì)性腺軸的影響不明顯。縱觀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，有關(guān)研究睪丸性不育動(dòng)物的模型實(shí)驗(yàn)有多種，就實(shí)際操作方面而言，以腺嘌呤模型的效果最為理想。高濃度的腺嘌呤代謝產(chǎn)物可以直接毒害腎臟和睪丸的生殖細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞，鏡檢腎組織呈萎縮傾向，結(jié)締組織增生，睪丸組織萎縮，大部分生精小管退行性變化，精子產(chǎn)生減少或缺損等病理改變可作為腎陽(yáng)虛證的客觀指標(biāo)[3-4]。有研究報(bào)道，從“腎主生殖”角度評(píng)價(jià)腺嘌呤與氫化可的松誘導(dǎo)的腎陽(yáng)虛模型，認(rèn)為腺嘌呤誘導(dǎo)的腎陽(yáng)虛證SD大鼠模型在形態(tài)學(xué)與性腺指標(biāo)方面更符合中醫(yī)腎陽(yáng)虛形態(tài)學(xué)表現(xiàn)[5]。本研究造模結(jié)果證實(shí)，模型大鼠從腺嘌呤灌喂開始逐漸出現(xiàn)喜暖怕冷、倦縮拱背、毛無(wú)光澤散亂、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，形體消瘦，生長(zhǎng)緩慢等“腎陽(yáng)虛”表現(xiàn)；模型大鼠睪丸病理組織學(xué)觀察所見，大鼠生精小管受損明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，溫腎丸干預(yù)后可改善造模大鼠的腎陽(yáng)虛證現(xiàn)象，有效緩解大鼠睪丸生精小管和生精細(xì)胞的損傷，提高生精障礙大鼠睪丸病理組織Johnson評(píng)分。

性激素FSH、LH、T的變化與生精功能狀態(tài)有著密切的關(guān)系，睪丸的支持細(xì)胞與生精細(xì)胞共同構(gòu)成睪丸的曲細(xì)精管，為精子發(fā)生提供獨(dú)特的微環(huán)境。睪丸生精功能主要受下丘腦—垂體—睪丸軸調(diào)控，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)作用于腦垂體，使其合成和分泌卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)。精子發(fā)生是FSH作用于支持細(xì)胞與LH通過(guò)刺激間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮(T)相互協(xié)同作用的結(jié)果[6-7]。以往的實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，腎陽(yáng)虛證存在著下丘腦—垂體—性腺軸不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂；補(bǔ)腎中藥能夠通過(guò)減輕性腺激素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷，改善下丘腦—垂體—性腺軸的功能而治療不育[8-12]。本研究結(jié)果顯示，溫腎丸干預(yù)后大鼠血清T水平上升，F(xiàn)SH下降，表明溫腎丸能夠調(diào)節(jié)模型大鼠的性激素水平，使受損的生精功能得到不同程度改善。此外， FSH在生精過(guò)程中除直接啟動(dòng)精原細(xì)胞的分裂和早期生精細(xì)胞發(fā)育外，還促使支持細(xì)胞分泌抑制素B(inhibinB，INHB)，INHB被認(rèn)為是反映支持細(xì)胞功能的血清標(biāo)記物，其能夠選擇性地抑制腦垂體合成和分泌FSH，還可以阻斷下丘腦刺激引起的垂體FSH釋放，對(duì)FSH的分泌發(fā)揮著極強(qiáng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[13]。相關(guān)研究報(bào)道，當(dāng)睪丸生精功能受損時(shí)，血清 INHB 水平下降；INHB血清水平與精子密度、精子總數(shù)呈顯著正相關(guān)，與血清FSH呈顯著負(fù)相關(guān)[14]。Pierik等[15]應(yīng)用睪丸活檢評(píng)分(Johnsen評(píng)分)評(píng)價(jià)FSH、INHB對(duì)精子發(fā)生正?；蛘系K的準(zhǔn)確性，認(rèn)為INHB的相關(guān)系數(shù)較FSH的相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，溫腎丸中、高劑量組大鼠血清 INHB水平均高于模型對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。

本研究結(jié)果表明，通過(guò)溫腎丸治療后模型大鼠腎陽(yáng)虛癥狀得到明顯改善，而且能有效調(diào)節(jié)紊亂的性激素水平及上調(diào)INHB水平；睪丸病理觀察及Johnsen評(píng)分提示受損的大鼠睪丸生精功能得到較好的緩解和修復(fù)，從而為溫腎丸在臨床治療腎陽(yáng)虛型男性不育提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。