郭倫鋒 劉尹 郭軍 李瑤 劉鐵明 袁鷹 董明芝 謝艷華 王四旺△

(1.安康市中心醫(yī)院藥劑科，陜西 安康 725000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院B超室，陜西 西安 710032；3.西北大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710069；4.西安正大制藥有限公司，陜西 西安 710043)

艽龍膠囊是由秦艽單味中藥材提取物制備而成的膠囊劑，其內(nèi)容物為黃色至棕色的顆粒，味苦、微澀；具有清肝泄熱的功效，適用于功能性消化不良屬肝胃郁熱證者，癥見胃脘飽脹、脘部燒灼、口干口苦等病證。本課題組前期研究中，標(biāo)定了艽龍膠囊HPLC指紋圖譜的23個(gè)共有峰，相識(shí)度為0.966～0.982，并測定了10批制劑中馬錢苷酸、龍膽苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、山梔苷甲酯、獐芽菜苷、異葒草苷、異牡荊黃素的含量。我們發(fā)現(xiàn)艽龍膠囊中龍膽苦苷含量最高(占比達(dá)65%以上)，其次為馬錢苷酸(約占15.0%)，再次為6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(約占6.5%)。由此結(jié)果可以看出，艽龍膠囊系多化學(xué)成分復(fù)方制劑，其在體內(nèi)發(fā)揮作用可能具有多靶點(diǎn)效應(yīng)。潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)系臨床消化科常見、難治性疾病，至今其發(fā)病原因尚不明確。由于大腸粘膜慢性炎癥和潰瘍性病變，臨床主要表現(xiàn)出腹痛、腹瀉、里急后重和粘液膿血便等癥狀。雖然UC不是危及生命的疾病，但嚴(yán)重影響著人們的身體健康和生活質(zhì)量，對(duì)家庭和社會(huì)醫(yī)療保障等造成沉重負(fù)擔(dān)，至今UC尚無專科特效治療藥物。龍膽苦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、清除自由基和治療胰腺炎等藥理作用[3-4]。王海波等證實(shí)龍膽苦苷對(duì)熱和化學(xué)刺激引起的疼痛反應(yīng)有明顯的鎮(zhèn)痛作用，對(duì)急、慢性炎癥反應(yīng)均有一定的抑制作用。張麗等報(bào)道龍膽苦苷可明顯減輕脂多糖致急性肺損傷小鼠肺組織炎癥反應(yīng)程度，具有較好的抗急性肺損傷作用?；谲待埬z囊含有65%以上龍膽苦苷，亦未見其對(duì)UC預(yù)防或治療作用的研究報(bào)道，本文探討了艽龍膠囊及其主成分對(duì)UC小鼠保護(hù)作用，為尋求有效治療UC的藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物為SPF級(jí)C57/BL6小鼠80只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，雄性，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(軍)2012-0007。動(dòng)物在獨(dú)立換氣籠盒(IVC系統(tǒng))飼養(yǎng)，溫度22～26 ℃，濕度50%～70%，12 h光照/黑暗周期循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。所需飼料和舒克貝塔SPF級(jí)精選刨花墊料購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。藥物為艽龍膠囊(西安正大制藥有限公司提供，批號(hào)20170216K)，龍膽苦苷(純度98%，批號(hào)201703112，上海純優(yōu)生物科技有限公司)，馬錢苷酸(純度98%，批號(hào)201701201，上海純優(yōu)生物科技有限公司)，6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(純度98%，批號(hào)201802093，上海純優(yōu)生物科技有限公司)，巴柳氮鈉(湖北百科亨迪藥業(yè)有限公司，批號(hào)170801)，美沙拉嗪(上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號(hào)170422)。試劑與儀器為葡聚糖硫酸鈉(美國MP，批號(hào)Q8758)，惠安易特敏E-termine FOB糞便隱血檢測試劑盒(深圳惠安生物科技有限公司，批號(hào)20180111)，NO檢測分析試劑盒(艾美捷科技有限公司，批號(hào)K262-200)，小鼠血管活性腸肽ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒(上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)20171223)，小鼠P 物質(zhì)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海研生實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)20180117)，TNF-α小鼠ELISA檢測試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司，批號(hào)HL20044)。Modle型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)，5418R低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，ME235S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 方法 (1)分組與模型制備：將C57/BL6小鼠隨機(jī)分為8組，分別為正常對(duì)照組、模型組、艽龍膠囊組(62 mg/kg)、龍膽苦苷組(40 mg/kg)、馬錢苷酸組(9 mg/kg)、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(4 mg/kg) 組、巴柳氮鈉組(500 mg/kg)及美沙拉嗪組(900 mg/kg)。采用自由飲用2.5%DSS建立UC小鼠模型，實(shí)驗(yàn)開始后除正常組外，其余組小鼠飲用水均用3%DSS水溶液代替，供小鼠自由飲用(DSS水溶液每天新鮮配置)，造模周期7 d。(2)給藥方法：造模開始同時(shí)給予治療藥物，即從第1天開始各組灌胃相應(yīng)劑量治療藥物，正常組和模型組給予等容量生理鹽水。艽龍膠囊和陽性藥物巴柳氮鈉及美沙拉嗪給藥劑量均根據(jù)臨床用量換算(小鼠給藥劑量=人每天用量/70 kg體質(zhì)量×9.1)，龍膽苦苷、馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷劑量均根據(jù)我們測得其艽龍膠囊中的含量確定。(3)檢測指標(biāo)與方法：①疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分。DAI評(píng)分是用于判斷UC的一個(gè)重要指標(biāo)，以小鼠體質(zhì)量下降程度、大便性狀及血便情況進(jìn)行綜合評(píng)分，評(píng)價(jià)UC小鼠的發(fā)病程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0分：體質(zhì)量下降0%，大便正常，無隱血；1分：體質(zhì)量下降1%～5%，大便松散，隱血陽性；2分：體質(zhì)量下降6%～10%，大便松散，輕微肉眼可見血便；3分：體質(zhì)量下降11%～15%，稀便，明顯肉眼可見血便。第7天對(duì)所有小鼠進(jìn)行DAI評(píng)分。②結(jié)腸粘膜損傷指數(shù)(colonmucosa damage index，CMDI)評(píng)分。第7天給藥結(jié)束后，禁食不禁水12h，眼底靜脈叢采血后，分離自肛門2 cm處向上8 cm的結(jié)腸，沿腸系膜縱向剖開腸腔，記錄糞便形狀及便血發(fā)生情況，用生理鹽水洗凈，吸去水分，稱重；腸粘膜朝上平鋪于玻璃板上，使用放大鏡眼觀，按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施CMDI評(píng)價(jià)，動(dòng)物結(jié)腸大體形態(tài)無損傷評(píng)為0分；結(jié)腸粘膜輕度充血，水腫，表面光滑，無糜爛或潰瘍評(píng)為1分；結(jié)腸粘膜充血水腫，粘膜粗糙呈顆粒狀，有糜爛或腸粘連評(píng)為2分；結(jié)腸高度充血水腫，粘膜表面有壞死及潰瘍形成，潰瘍最大縱徑小于1.0 cm，腸壁增厚或表面有壞死及炎癥評(píng)為3分；結(jié)腸在3分基礎(chǔ)上潰瘍最大縱徑大于1.0 cm 或全腸壁壞死評(píng)為4分；同時(shí)記錄結(jié)腸的潰瘍數(shù)及其潰瘍面積。③結(jié)腸組織病理學(xué)分析。取出10%多聚甲醛固定后的結(jié)腸，縱向切取0.2 mm，包埋并切取3～5 μm的蠟片，用hematoxylin-eosin staining(H&E)染色，在200倍顯微鏡下觀察組織病理改變情況，并進(jìn)行炎癥評(píng)分。組織病理學(xué)損傷依據(jù)之前報(bào)道[9-10]進(jìn)行blinded fashion評(píng)分。即：炎癥細(xì)胞浸潤程度(0分：無；1分：粘膜層炎細(xì)胞浸潤；2分：粘膜層及粘膜下層炎細(xì)胞浸潤；3分：炎細(xì)胞浸潤至肌層)；隱窩破壞(0分：無；1分：基底1/3隱窩被破壞；2分：基底2/3隱窩被破壞；3分：全部隱窩被破壞)；病變范圍(0分：<1%；1分：1%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)。④血清及結(jié)腸組織中相關(guān)指標(biāo)檢測。采血后，室溫靜置3 h，3 500 rpm離心15 min，分離上層血清，按照試劑盒要求檢測血清中NO含量和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。結(jié)腸組織肉眼觀察結(jié)束后，分離一部分，稱重，單面刀片切碎轉(zhuǎn)入組織勻漿器，加1 mL pH7.4 PBS液，勻漿，3500 rpm低溫離心，上清液在-20 ℃保存，按照檢測試劑盒說明檢測血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和小鼠P物質(zhì)(substance P，SP)含量。

2 結(jié) 果

2.1 DAI和CMDI評(píng)分 造模第7天，正常組小鼠活動(dòng)自如，被毛光澤，飲食規(guī)律，大便呈顆粒狀，便隱血陰性，體質(zhì)量呈明顯增加趨勢，結(jié)腸粘膜眼觀完整、光滑，皺襞和紋理清晰，無充血、水腫、潰瘍，腸管厚度均勻；模型組小鼠體質(zhì)量明顯下降，外觀可見精神疲倦，活動(dòng)減少，毛色無光澤，出現(xiàn)嚴(yán)重血便和粘液便，結(jié)腸粘膜肉眼見糜爛或壞死，程度不等的腸擴(kuò)張、腸縮短，腸管增厚、充血、水腫、散在潰瘍和出血及腸粘連，艽龍膠囊、龍膽苦苷、馬錢苷酸及陽性藥物組體質(zhì)量下降不明顯，精神狀態(tài)、被毛色澤、活動(dòng)程度等均明顯好于模型組動(dòng)物，結(jié)腸粘膜肉眼所見組織形態(tài)及腹瀉和隱血病癥等明顯見減輕；6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組與模型組比較，癥狀有所減輕，但體質(zhì)量仍呈下降趨勢，且出現(xiàn)明顯血便。見圖1。

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較#P<0.01。

圖1 各試藥對(duì)UC小鼠的DAI評(píng)分及CMDI評(píng)分

2.2 各試藥對(duì)UC小鼠組織病理學(xué)影響 H&E染色結(jié)果表明，正常組小鼠結(jié)腸鏡下形態(tài)完整，腺體排列整齊，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組鏡下可見大量炎性細(xì)胞浸潤并累及全層，杯狀細(xì)胞消失，黏膜損壞嚴(yán)重，大部分隱窩損壞；艽龍膠囊、龍膽苦苷、馬錢苷酸及陽性藥物組細(xì)胞排列較整齊，組織形態(tài)正常，隱窩形態(tài)完整，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤；6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組黏膜下層仍有較多炎性細(xì)胞浸潤，但隱窩損壞程度減小，細(xì)胞排列較整齊，炎癥程度有所減輕。見圖2。

圖2 各試藥對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)影響

2.3 各試藥對(duì)UC小鼠血清中NO及TNF-α的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清中NO和TNF-α含量顯著升高；與模型組相比，艽龍膠囊、龍膽苦苷、馬錢苷酸及各陽性藥物組血清中NO及TNF-α含量顯著降低；與模型組相比，6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組血清中NO含量與模型組相比無顯著性差異，TNF-α含量與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較#P<0.01。

圖3 各試藥對(duì)UC小鼠血清中NO及TNF-α含量的影響

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較#P<0.01。

圖4 各試藥對(duì)UC小鼠結(jié)腸中VIP及SP的影響

2.4 各試藥對(duì)UC小鼠結(jié)腸中VIP及SP的影響 與正常組小鼠相比，模型組小鼠結(jié)腸中VIP和SP含量顯著升高；與模型組相比，艽龍膠囊、龍膽苦苷、馬錢苷酸及各陽性藥物組結(jié)腸中VIP和SP含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷組小鼠結(jié)腸中VIP和SP含量與模型組無顯著性差異。

3 討 論

UC的病因至今尚不明確，不少學(xué)者認(rèn)為UC的發(fā)病與基因因素、自身免疫和外源物質(zhì)誘發(fā)宿主反應(yīng)密切相關(guān)。血性腹瀉是UC早期最常見的病癥，繼而可出現(xiàn)腹痛、頻繁血便、體質(zhì)量下降、里急后重、嘔吐或伴發(fā)高熱等癥狀，個(gè)別病人還可伴發(fā)關(guān)節(jié)炎、虹膜睫狀體炎、肝功能障礙和皮膚病變等?；贘iang的研究[11]，我國目前UC發(fā)病率已增長至0.45/萬。近十余年來，UC的治療雖已取得明顯進(jìn)展，但其藥物治療主要還是在控制環(huán)境、免疫、遺傳和腸道微生態(tài)的相互作用的基礎(chǔ)上才具有明顯療效，并非藥物的直接治療作用[12]。

本研究采用成人日用劑量的艽龍膠囊及其主成分占比換算劑量灌胃給予UC小鼠一周，結(jié)果顯示艽龍膠囊及其主成分龍膽苦苷和馬錢苷酸能夠顯著改善UC小鼠DAI和CMDI評(píng)分，顯著降低UC小鼠血清NO和TNF-α含量，同時(shí)還能降低結(jié)腸組織SP和VIP含量。由此說明，(1)艽龍膠囊作為主治功能性消化不良的藥物對(duì)UC的發(fā)生具有顯著的預(yù)防作用；(2)艽龍膠囊預(yù)防UC的功效成分主要是龍膽苦苷和馬錢苷酸；(3)鑒于龍膽苦苷和馬錢苷酸的總體療效低于艽龍膠囊(無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)，但其趨勢亦表明艽龍膠囊系多成分的復(fù)方發(fā)揮著協(xié)同作用；(4)基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測艽龍膠囊對(duì)UC可能也具有很好的治療作用，但有待下一步研究闡明。