張留魯 邵和軍

(貴州省人民醫(yī)院感染科，貴州 貴陽 550002)

急性肝功能衰竭具有起病急、預(yù)后差及病死率高的特點，經(jīng)過多年的研究，現(xiàn)已證實以單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞動員和白介素1(interleukin-1，IL-1)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)多種炎性因子的過度釋放為代表的免疫系統(tǒng)過度活化在急性肝功能衰竭過程中發(fā)揮重要作用[1]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是一種模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，可表達(dá)于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[2]。核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor kB，NF-κB) 是許多炎癥細(xì)胞因子基因的啟動因子，可以有效誘導(dǎo)炎癥因子、趨化因子、炎性酶等的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大，可在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化，NF-κB在炎癥反應(yīng)中起著主要作用，RAGE與配體結(jié)合后可激活細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶途經(jīng)，啟動活化核因子NF-κB，介導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，形成持續(xù)性的炎癥活化正反饋作用，因此，RAGE激活后不僅參與炎癥反應(yīng)，還可加強持續(xù)炎癥反應(yīng)并且導(dǎo)致炎癥反應(yīng)慢性化。

1 材料與方法

1．1 材料及實驗方法 雄性昆明種SCXK(黔)2012-001小鼠40只，體質(zhì)量(20±1.7) g。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為：正常對照組(n=8只)，肝衰竭模型4 h組(n=8只)、8 h組(n=8只)、12 h組(n=8只)及24 h組(n=8只)。急性肝衰竭模型復(fù)制：新鮮配制D-氨基半乳糖及LPS溶液(用生理鹽水將D-氨基半乳糖及LPS配成D-GalN50 mg/mL、LPS1 μg/mL)，按D-GalN500 mg/kg、LPS10 μg/kg的劑量腹腔注射一次。肝衰竭組在建模后4 h、8 h、12 h和24 h(實驗中18 h后死亡小鼠計入24 h組)眼球取血后斷頸處死各組小鼠，留取血液及全部肝臟。血液4 ℃離心1 500 rpm×10 min后，分離血清，置-80 ℃冰箱保存。取各小鼠右葉肝組織1.3 mm3大小于4%中性甲醛固定，其余肝組織置-80 ℃冰箱保存。

1.2 檢測指標(biāo)及方法

1.2.1 血清ALT、AST、TBIL含量檢測 血清ALT、AST、TBIL含量測定采用Siemens Advia 1650全自動生化分析儀，由貴州省人民醫(yī)院生化科嚴(yán)格按照試劑盒要求測定。

1.2.2 光鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu) 肝右葉組織浸于4%中性甲醛緩沖液中固定48 h以后，轉(zhuǎn)移到0.1 mol/L的PBS溶液中保存，常規(guī)石蠟包埋切片行HE染色.

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測晚期糖基化終末產(chǎn)物受體、核轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)：采用SP法，微波加熱抗原修復(fù)，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。兔抗人RAGE、NF-κB單克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)公司)。操作程序按說明書進(jìn)行。陰性對照以PBS替代一抗，用已知陽性標(biāo)本作陽性對照。染色結(jié)果判斷：光鏡下觀察細(xì)胞呈棕黃色為陽性表達(dá)細(xì)胞，每張切片在高倍鏡下隨機(jī)取5個視野，分別按染色深度和陽性細(xì)胞的分布作如下評分：(1)無著色為 0 分，淡黃色為 1 分，棕黃色為 2 分，棕褐色為 3 分；(2)陽性范圍：沒有陽性細(xì)胞為 0 分，陽性細(xì)胞百分比<10%為 1 分，陽性細(xì)胞百分比11%～50%為2 分，陽性細(xì)胞百分比51%～80%為 3 分，陽性細(xì)胞百分比>80%為 4 分。以二者分?jǐn)?shù)乘積，通過兩者乘積結(jié)果進(jìn)行半定量統(tǒng)計。

1.2.4 熒光實時定量PCR 肝臟組織50 mg加入Trizol 1.0 mL充分勻漿后離心，取上清液，酶標(biāo)儀測定RNA濃度。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄20 μL體系(5×buffer 4 μL、10 mmol /L dNTP 2 μL、Olig DT 1 μL、RNase Inhibitor1 μL、RNA 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、RNase-free H2O 9.0 μL、模板2 μL); 逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min、4 ℃保存; RT-PCR 20 μL 體系(2 ×SYBR Green 10 μL、primer mix 1.0 μL、RNase-freeH2O 7.0 μL、模板2.0 μL); 循環(huán)參數(shù)：50 ℃ 120 s、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s ，共40 個循環(huán)。RAGE引物序列上游5’-CAGTCAGAGGAAGCGGAGAT-3’，下游5’-CTGGTTGGAGAAGGAAGTGC-3’ ；NF-KBp65引物序列上游5’-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3’，下游5’-ACTGTCACCTGGAAGCAGAG-3’。β-actin 序列：上游5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。所有引物均采用Primer 3.0 設(shè)計并經(jīng)過NCBI Blast 驗證產(chǎn)物特異性。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL濃度 小鼠注射D-GalN+LPS后，模型組AST、ALT濃度逐漸升高，12 h達(dá)高峰，24 h維持在較高水平，模型組小鼠血清AST、ALT濃度顯著高于正常對照組小鼠(P<0.01)；肝衰竭組小鼠血清TBIL濃度逐漸升高，24 h達(dá)高峰，肝衰竭組8 h、12 h、24 h組小鼠血清TBIL濃度高于正常對照組小鼠(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL濃度

注：與對照組相比，#P<0.01，※P<0.05。

2.2 各組小鼠肝組織學(xué)變化 正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整。模型組隨著給藥時間延長，肝組織的病理改變逐漸加重， 4 h時肝細(xì)胞輕度腫脹，嗜酸性變、炎細(xì)胞浸潤，可見核內(nèi)包涵體，肝細(xì)胞呈點狀壞死；8 h時肝細(xì)胞氣球樣變，匯管區(qū)及肝細(xì)胞間見炎細(xì)胞浸潤伴出血，可見核內(nèi)包涵體，肝細(xì)胞呈橋接壞死；12 h時可見肝細(xì)胞片狀壞死融合，核溶解、碎裂，匯管區(qū)及肝細(xì)胞間見較多炎細(xì)胞浸潤伴少量出血；24 h時肝細(xì)胞壞死更加明顯，大片狀壞死和少量出血，僅少量肝細(xì)胞殘存，散在分布，纖維網(wǎng)狀支架塌陷。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果

2.3 免疫組化檢測各組小鼠肝組織中RAGE、NF-κBp65蛋白表達(dá)變化 RAGE蛋白表達(dá)：正常對照組小鼠肝組織中很少表達(dá)。肝衰竭4 h組炎細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞胞漿低表達(dá)， 8 h、12 h組表達(dá)呈陽性，炎性浸潤區(qū)陽性細(xì)胞胞漿表達(dá)明顯增加，24 h組，壞死區(qū)炎細(xì)胞陽性表達(dá)。NF-κBp65 蛋白表達(dá)：正常對照組主要為肝細(xì)胞染色陽性，細(xì)胞胞漿有弱表達(dá)。肝衰竭4 h組核陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯增多，8 h組、12 h組表達(dá)呈肝細(xì)胞胞漿強陽性，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和炎細(xì)胞胞漿有陽性表達(dá)，隨著肝細(xì)胞壞死的加重， 24 h組陽性細(xì)胞表達(dá)減少，壞死區(qū)陽性表達(dá)明顯增加。經(jīng)檢驗，模型8 h、12 h、24 h組RAGE蛋白、NF-κBp65 蛋白表達(dá)較正常對照組差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、圖3；

正常組(SABC，×400)

注：箭頭所示為陽性表達(dá)。

圖2 各組小鼠肝組織中RAGE蛋白表達(dá)結(jié)果

注：箭頭所示為陽性表達(dá)。

圖3 各組小鼠肝組織中NF-κBp65蛋白表達(dá)結(jié)果

2.4 各組小鼠肝組織中RAGEmRNA 、NF-kBp65mRNA表達(dá)水平 建模后肝衰竭組RAGEmRNA表達(dá)開始上調(diào)，持續(xù)升高，24 h達(dá)到高峰，經(jīng)檢驗，肝衰竭組8 h、12 h、24 h組RAGEmRNA的表達(dá)較正常組增加(P<0.05)； 建模后肝衰竭組NF-kB65 mRNA水平表達(dá)開始上調(diào)，12 h達(dá)到高峰，24 h維持在較高水平，經(jīng)檢驗，肝衰竭組8 h、12 h、24 h組NF-kBp65 mRNA的表達(dá)較正常組明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠肝組織中RAGEmRNA 、NF-kBp65mRNA表達(dá)

注：與對照組相比，※P<0.05。

3 討 論

急性肝功能衰竭(acute liver failure，ALF)可由包括藥物、毒物、病毒感染等多種原因引起，病理生理學(xué)上表現(xiàn)為肝細(xì)胞大量壞死、凋亡，導(dǎo)致肝臟合成、解毒、轉(zhuǎn)運和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙，繼而出現(xiàn)以嚴(yán)重消化道癥狀、極度乏力、凝血功能障礙、深度黃疸、肝性腦病、腹水等臨床癥候群[3]。

RAGE 是細(xì)胞表面分子中免疫球蛋白超家族的一員，在體內(nèi)分布非常廣泛，可表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等[4-5]。Harashima等應(yīng)用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在肉芽腫性炎癥、吸煙相關(guān)性氣道疾病、間質(zhì)性肺炎等幾種持續(xù)性炎癥性肺病的患者肺內(nèi)RAGE蛋白表達(dá)增強[6]，RAGE激活后不僅參與炎癥反應(yīng)，還可加強持續(xù)炎癥反應(yīng)并且導(dǎo)致炎癥反應(yīng)慢性化。

NF-κB是許多炎癥細(xì)胞因子基因的啟動因子，可以有效誘導(dǎo)炎癥因子、趨化因子、炎性酶等的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大，在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化，因此在炎癥反應(yīng)中起著主要作用。研究證實RAGE與配體結(jié)合后形成的復(fù)合物可激活細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶途經(jīng)，啟動活化核因子NF-κB，進(jìn)而激活RAGE基因啟動子，形成持續(xù)性的炎癥活化正反饋作用。

本研究以昆明種小鼠為動物實驗?zāi)Ｐ?，以D-氨基半乳糖和脂多糖成功復(fù)制了陳恩強等[7]建立的動物急性肝功能衰竭模型。生化檢查示以D-氨基半乳糖和脂多糖處理小鼠后，在4～12 h內(nèi)均出現(xiàn)ALT、AST、TBIL升高；4 h小鼠的肝臟組織學(xué)檢查已經(jīng)出現(xiàn)肝細(xì)胞變性表現(xiàn)，8 h內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞明顯壞死，而至24 h時肝臟組織學(xué)破壞程度達(dá)到峰值，出現(xiàn)大片壞死，僅有少量肝細(xì)胞殘存，本研究建立的動物模型合理地體現(xiàn)急性肝功能衰竭病理生理過程。

本研究實驗過程中，隨肝細(xì)胞損傷程度加重，免疫組化顯示RAGE蛋白主要由炎癥細(xì)胞表達(dá)，所以在實驗起始階段，肝臟組織內(nèi)的表達(dá)量極低，在肝細(xì)胞損害后，肝組織炎細(xì)胞浸潤發(fā)生后，炎細(xì)胞內(nèi)RAGE蛋白及mRNA水平逐漸升高，并伴隨了整個肝臟損害過程的進(jìn)展。在組織學(xué)表現(xiàn)上，RAGE蛋白表達(dá)水平變化幾乎可以有效地代表肝組織內(nèi)炎細(xì)胞的數(shù)量變化，提示RAGE在急性肝功能衰竭模型肝損害過程中有重要的意義。同時免疫組化檢測肝組織內(nèi)NF-kBp65蛋白水平顯示肝衰竭4 h時主要表達(dá)于肝細(xì)胞核，8 h之后多見于肝細(xì)胞壞死區(qū)染色，此時，NF-κB在肝臟炎細(xì)胞及炎性細(xì)胞表達(dá)增強，12 h、24 h時肝細(xì)胞壞死區(qū)域及浸潤的炎癥細(xì)胞中表達(dá)增加。因此晚期糖基化終末產(chǎn)物受體及核轉(zhuǎn)錄因子在D-GalN+LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肝功能衰竭過程中起著重要作用，這為臨床上尋治療肝衰竭提供了理論基礎(chǔ)及新的思路。