陳關(guān)雄 向必勇 幸更東 臺(tái)曉媛*

（1.石林彝族自治縣畜牧獸醫(yī)總站，云南石林 652200；2.云南省種羊繁育推廣中心，云南尋甸 655200；3.玉溪市紅塔區(qū)畜禽改良站，云南玉溪 653100）

豬丹毒（Swine erysipelas）是由紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的豬的一種急性熱性傳染病[1]。1876年Koch首次從患有敗血病小鼠的血液中分離出本菌，1882年Louis Pasteur首次從病豬體內(nèi)分離到本菌[2]。目前該病在世界上大多數(shù)國(guó)家都有分布，呈散發(fā)或流行性發(fā)生，不同年齡、性別和品種的豬均有易感性，但以3個(gè)月以上的生長(zhǎng)豬發(fā)病率最高，牛、羊、馬、犬、家禽及一些鳥(niǎo)類均可發(fā)病，也能危害人類健康[3-4]。臨床病例可分為急性型、亞急性型和慢性型，急性型表現(xiàn)為體溫急劇升高至42℃以上，病豬突然死亡，在頸部、耳后以及胸腹側(cè)等處的皮膚上出現(xiàn)形狀不同的紅斑，手指按壓會(huì)褪色；亞急性型表現(xiàn)為，在頸部、背部、胸側(cè)以及四肢外側(cè)等皮膚上出現(xiàn)不同大小的深紅色疹塊，扁平凸起，彼此間存在清晰界限；慢性型表現(xiàn)為皮膚壞死，漿液性纖維素性關(guān)節(jié)炎和疣狀心內(nèi)膜炎[5]。

豬丹毒的實(shí)驗(yàn)室診斷主要分為細(xì)菌的分離鑒定、血清學(xué)診斷和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[6－7]。本研究通過(guò)對(duì)臨床疑似豬丹毒發(fā)病死亡的生豬進(jìn)行解剖，采集腎臟、脾臟和淋巴結(jié)進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，通過(guò)形態(tài)觀察、生化鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)及藥物敏感性試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行診斷和分析，為豬丹毒的預(yù)防和治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 石林縣某養(yǎng)殖戶臨床疑似豬丹毒發(fā)病死亡的生豬，經(jīng)解剖，無(wú)菌采取腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織待用。

1.1.2 培養(yǎng)基 鮮血瓊脂培養(yǎng)基、5%馬血清瓊脂培養(yǎng)基、5%馬血清肉湯培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇、棉子糖、甘露醇、菊糖、蕈糖、蔗糖、水楊苷、尿素、H2S、MR、VP、靛基質(zhì)、明膠。

1.1.4 試驗(yàn)設(shè)備 高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、生物顯微鏡、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、試管、培養(yǎng)皿等，抗菌藥物藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將采集到的腎臟、脾臟等樣品無(wú)菌操作劃線接種于鮮血培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h－48h，觀察菌落形態(tài)特征，挑取可疑菌落再次劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基或5%馬血清瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)，然后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。

1.2.2 分離菌株的鑒定

（1）鏡檢：挑取分離菌落均勻涂布于載玻上，經(jīng)酒精火焰固定后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

（2）糖發(fā)酵試驗(yàn)：挑取分離菌株分別接種于含5%馬血清的糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，根據(jù)指示劑的顏色變化，觀察分離菌株對(duì)糖的分解利用情況。

（3）生化試驗(yàn)：挑取分離菌株分別進(jìn)行尿素試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、明膠穿刺試驗(yàn)，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h（明膠穿刺試驗(yàn)20℃）后，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 動(dòng)物試驗(yàn) 將分離菌株接種于5%馬血清肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，取肉湯培養(yǎng)物1ml經(jīng)胸肌分別接種3只家鴿，另取1ml肉湯培養(yǎng)物經(jīng)皮下接種2只豚鼠作對(duì)照，連續(xù)觀察一周，記錄發(fā)病及死亡情況。對(duì)攻毒死亡家鴿進(jìn)行解剖，采取心血和肝臟等進(jìn)行涂片染色和分離培養(yǎng)，并與分離菌株進(jìn)行對(duì)照分析。

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn) 挑取豬丹毒分離純培養(yǎng)菌株接種于5%馬血清肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h后，取100μl培養(yǎng)物均勻涂布于5%馬血清瓊脂培養(yǎng)基，正向置于恒溫培養(yǎng)箱，37℃干燥1h，用無(wú)菌攝子夾取藥敏紙片貼于瓊脂表面，37℃倒置恒溫培養(yǎng)24h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，記錄試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判定參照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）2012版（標(biāo)準(zhǔn)）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，同時(shí)以杭州微生物試劑有限公司提供的紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)作為參考。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性與細(xì)菌形態(tài)

37℃培養(yǎng)24h后，在鮮血瓊脂上形成針尖大小，露珠樣菌落，菌落呈圓形、灰白色，表面光滑、濕潤(rùn)，中部凸起，邊緣整齊，菌落直徑1-2mm。革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體平直或稍彎曲的纖細(xì)小桿菌，兩端鈍圓，無(wú)鞭毛、無(wú)莢膜、不產(chǎn)生孢，呈V形、短鏈或堆狀排列（圖1、2）。

圖1 鮮血瓊脂培養(yǎng)物（100×16 革蘭氏染色）

圖2 馬血清肉湯培養(yǎng)物（100×16 革蘭氏染色）

2.2 生化試驗(yàn)

在加有5%馬血清的糖培養(yǎng)基中可發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)生；不發(fā)酵蔗糖、甘露醇、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、菊糖、蕈糖、水楊苷。能產(chǎn)生H2S，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，MR及VP試驗(yàn)無(wú)陰性，不分解尿素（詳見(jiàn)表1）。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 明膠穿刺試驗(yàn)

明膠穿刺試后，分離菌株沿穿刺線橫向四周生長(zhǎng)，呈試管刷狀，不液化明膠（圖3）。

圖3 明膠穿刺試驗(yàn)

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

將分離菌株培養(yǎng)物分種接種3只家鴿和2只豚鼠，在接種后18h，家鴿表現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬松、活躍程度下降、不食等癥狀；接種72h后，3只家鴿全部死亡，2只豚鼠均健康；觀察至第7天，2只豚鼠仍然健康存活。對(duì)死亡的3只家鴿進(jìn)行解剖，無(wú)菌采取家鴿的心血、肝臟分別進(jìn)行涂片染色和分離培養(yǎng)。經(jīng)涂片染色，可見(jiàn)大量纖細(xì)的革蘭氏陽(yáng)性小桿菌，呈V形、短鏈或堆狀排列；將采集的肝臟、脾臟樣品劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h，形成針尖大小，露珠樣菌落，挑取菌落染色鏡檢和生化鑒定均和分離菌株的結(jié)果一致（圖4、5）。

圖4 鴿子肝臟觸片（100×16 革蘭氏染色）

圖5 鴿子心血觸片（100×16 革蘭氏染色）

2.5 藥敏試驗(yàn)

選用青霉素、氨芐西林、頭孢吡肟等14種抗生素對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果分離菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢曲松四種藥物敏感，對(duì)紅霉素、氟苯尼考兩種藥物中度敏感，對(duì)頭孢氨芐、多西環(huán)素、恩諾沙星、甲氧芐氨嘧啶、阿奇霉素、復(fù)方新諾明、丁胺卡那霉素、左氧氟沙星耐藥（詳見(jiàn)表2）

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)病死生豬的組織樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)、鏡檢形態(tài)、生化鑒定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)，確定分離菌株為豬丹毒桿菌。

表2 藥物試驗(yàn)結(jié)果

豬丹毒、豬瘟、豬肺疫在20世紀(jì)80年代和90年代初并稱我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)三大傳染病[8]，然而，隨著豬丹毒、豬瘟、豬肺疫疫苗和青霉素等抗菌藥物的使用，豬丹毒臨床病例已慢慢減少，在臨床上已很難見(jiàn)到發(fā)病的情況。近年來(lái)，國(guó)家對(duì)生豬疫病防控重點(diǎn)隨著生豬疫病的流行情況發(fā)生了改變，生豬養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）生豬疫病的防控重點(diǎn)也主要以病毒性疫病為主，往往忽略了細(xì)菌性疫病的防治，然而，丹毒絲菌可感染包括哺乳動(dòng)物、禽和魚(yú)類等70多種動(dòng)物，對(duì)鹽腌、火熏、干燥、腐敗和日光等自然環(huán)境抵抗力強(qiáng)；加之，由于抗生素殘留問(wèn)題，許多飼料生產(chǎn)企業(yè)已不在飼料中添加抗生素或減少抗生素的添加量；再之，豬丹毒與豬瘟、豬流行性腹瀉、豬藍(lán)耳、豬圓環(huán)等疫病伴發(fā)，能加重本病的發(fā)生與流行等原因，造成豬丹毒有卷土重來(lái)之勢(shì)，生豬養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）應(yīng)重視豬丹毒的防治工作。

本研究通過(guò)選擇臨床常用、革蘭氏陽(yáng)性菌敏感、廣譜的14種抗菌藥物，對(duì)分離菌株進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離的豬丹毒桿菌對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢吡肟和頭孢曲松四種藥物敏感，對(duì)紅霉素、氟苯尼考中度敏感，其余藥物均出現(xiàn)了耐藥的情況。在臨床診療過(guò)程中，治療豬丹毒首選的藥物還是青霉素類抗生素，當(dāng)發(fā)現(xiàn)使用的抗生素治療效果不好時(shí)，應(yīng)及時(shí)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，篩選敏感抗菌藥物來(lái)進(jìn)行治療，避免濫用藥物，以提高治療的效果，降低經(jīng)濟(jì)損失。