胡 浩，魏志平，劉彥群

內源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，ECS）是由內源性大麻素、大麻素受體——G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）以及相關的酶所組成的一種具有調節(jié)多種生理病理過程的信號系統(tǒng)，ECS在皮膚以及附屬器的各種細胞類型中對細胞增殖、分化、凋亡以及細胞因子等產生發(fā)揮重要的調節(jié)功能[1]。研究發(fā)現，大麻素2型受體（cannabinoid type 2 receptor，CB2R）在銀屑病皮損的角質形成細胞中大量表達，且主要分布于棘細胞層[2]。大麻素2型受體激動劑JWH133具有抑制腫瘤細胞增殖以及免疫反應的作用[1]。本研究初步揭示了JWH133對HaCaT細胞體外增殖、凋亡以及在腫瘤壞死因子（TNF）-α誘導下細胞表達細胞因子的影響，旨在探索JWH133對角質形成細胞的生物學作用。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和主要設備

人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞）株（上海復祥生物科技有限公司），大麻素2型受體激動劑JWH133（美國Tocris公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術研究所），Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司），TNF-α（美國PeproTech公司），人細胞因子檢測試劑盒（美國R&D公司），人白細胞介素（IL）-19、IL-22、IL-23酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（南京福麥斯生物技術有限公司），流式細胞儀（美國BD公司），多功能熒光化學發(fā)光成像儀（上海勤翔科學儀器有限公司）。JWH133以二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為50 mmol/L 儲存液（DMSO 濃度 ≤ 2‰），-20℃避光保存，使用時用DMEM培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 HaCaT細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長滿瓶底后，以含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化細胞，接種于培養(yǎng)瓶內，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，更換無血清、無雙抗DMEM培養(yǎng)基，并加入不同濃度JWH133。檢測JWH133對HaCaT細胞抑制率以及凋亡率實驗中，實驗分5組，分別為15、30、60 μmol/L JWH133組、溶媒組（含與60 μmol/L JWH133等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基）、陰性組（只含DMEM培養(yǎng)基）。檢測JWH133對TNF-α誘導的HaCaT細胞中有關細胞因子表達中，實驗分3組，分別為陰性組（只含DMEM 培 養(yǎng) 基）、 TNF-α 組（含有 20 ng/ml TNF-α DMEM 培養(yǎng)基）、TNF-α+30 μmol/L JWH133 組（先將含有20 ng/ml TNF-α DMEM培養(yǎng)基預處理2 h，再加30 μmol/L JWH133），3組細胞在培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)24 h，為后續(xù)實驗做準備。

1.2.2 CCK8法檢測JWH133對HaCaT細胞體外增殖的抑制作用 取HaCaT細胞5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔為 100 μl，置于 37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h待細胞貼壁，實驗分組如上所述，每組設4個復孔，分別培養(yǎng)12、24、36 h后終止培養(yǎng)，棄去原培養(yǎng)基，將無血清、無雙抗DMEM培養(yǎng)基與CCK-8試劑按10:1比例混勻，每孔加入100 μl混勻液，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀測定450 nm波長處每孔的吸光度（A值），實驗重復3次，計算細胞增殖抑制率，抑制率=（1-給藥組A值/陰性對照組A值）×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測JWH133對HaCaT細胞凋亡的影響 以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，待細胞長至70%～80%融合時，按上述實驗分組用不同濃度JWH133處理細胞，每組設3個復孔，24 h后以胰蛋白酶處理細胞，約3～5 min后用含血清的培養(yǎng)基終止消化，用預冷的PBS輕輕吹打成單細胞懸液，4℃1 000 r/min離心×5 min后棄上清，重復3次，將各組分別加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，并分別加入5 μl Annexin V-FITC混勻后加入5 μl碘化丙啶（PI），混勻，室溫避光反應5～15 min，在1 h內進行上機檢測。

1.2.4 抗體蛋白芯片檢測JWH133對HaCaT細胞中細胞因子表達的影響 取對數生長期的HaCaT細胞以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，按上述實驗分組進行實驗。培養(yǎng)24 h后收集各組細胞，提取總蛋白，并檢測蛋白濃度。每個樣本實驗區(qū)的微陣列中固定了105種細胞因子的抗體及陽性和陰性對照，每個細胞因子位點重復測定2次。具體操作按照試劑盒的說明書進行，其主要步驟如下：①每張膜加入2 ml Array Buffer孵育1 h做封閉處理。②每個Array單元分別加入200 μg樣本稀釋液4℃孵育過夜。③洗膜后分別加入稀釋過的檢測抗體，室溫孵育1 h。④洗膜后分別加入鏈霉親和素-HRP，室溫孵育30 min。⑤洗膜后分別加入1 ml化學顯色試劑。⑥化學發(fā)光成像儀上顯色及數據處理與分析。

表1 不同濃度JWH133作用HaCaT細胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用 （±s，n=3）

表1 不同濃度JWH133作用HaCaT細胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用 （±s，n=3）

注：A值：吸光度值；與陰性組相比，aP＞0.05；與溶媒組相比，bP＜0.05

組 別 12 h 24 h 36 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）陰性組 0.934±0.041 0 1.389±0.026 0 1.677±0.026 0溶媒組 0.920±0.022 a 1.47±2.31 a 1.372±0.031 a 1.24±0.59 a 1.646±0.024 a 1.84±1.45 a 15 μmol/L 0.736±0.021 b 21.02±4.29 b 0.646±0.021 b 53.52±1.47 b 0.429±0.028 b 74.42±1.38 b 30 μmol/L 0.630±0.021 b 32.41±4.26 b 0.396±0.012 b 71.46±0.97 b 0.254±0.018 b 84.85±0.88 b 60 μmol/L 0.486±0.010 b 47.90±3.30 b 0.265±0.018 b 80.92±1.07 b 0.207±0.014 b 87.68±0.76 bimages/BZ_8_1059_407_1106_449.pngimages/BZ_8_1640_406_1687_447.png

1.2.5 雙抗體夾心ELISA法檢測IL-19、IL-22、IL-23水平 取對數生長期的HaCaT細胞，以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，按上述實驗分組進行實驗。培養(yǎng)24 h后收集各組細胞上清，離心后采用ELISA法檢測IL-19、IL-22、IL-23水平，嚴格按照說明書進行操作，每個樣本設置4個復孔，用酶標儀讀取450 nm處A值，根據標準曲線計算各組IL-19、IL-22、IL-23的濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示。各組HaCaT細胞增殖抑制率隨時間的變化采用重復測量的方差分析。多個均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）?？贵w芯片結果采用HLIMAGE數據分析軟件進行分析，取經過軟件系統(tǒng)自動排除背景后每個細胞因子重復點灰度值的平均值（PAIRS）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 JWH133對HaCaT細胞體外增殖的影響

重復測量的方差分析顯示JWH133對HaCaT細胞體外抑制的抑制率有時間依賴性（F= 187.1，P＜0.05）；JWH133對HaCaT細胞體外抑制也有濃度依賴性（F= 2678.9，P＜0.05）；藥物濃度和時間之間存在交互效應（F= 1177.4，P＜0.05），說明時間因素的變化趨勢隨藥物濃度不同而不同。15 μmol/L JWH133作用12 h即開始表現出對HaCaT細胞體外抑制作用（圖1）。與陰性組相比，各濃度JWH133對HaCaT細胞體外增殖具有抑制作用（P均＜ 0.05，表1），且各濃度JWH133組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.05），JWH133濃度越高，抑制作用越強。隨著時間延長，各濃度JWH133對HaCaT細胞增殖的抑制作用亦逐漸增強，12～24 h的抑制率較24～36 h上升更快，故選擇24 h作為后續(xù)實驗的時間點。各時間點溶媒組HaCaT細胞體外抑制率與陰性組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P均＞ 0.05）。

2.2 JWH133對HaCaT細胞體外凋亡率的影響

流式細胞儀檢測結果顯示（表2），15、30、60 μmol/L JWH133作用HaCaT細胞24 h后，早期及中晚期細胞總凋亡率分別為（12.07±0.21）%、（18.13±0.21）%、（21.77±0.40）%，與陰性組（4.34±0.07）%相比差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。溶媒組（4.79±0.06）%與陰性組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其中60 μmol/L JWH133組作用最強。

2.3 JWH133對HaCaT細胞有關細胞因子表達的影響

圖1 不同濃度JWH133作用HaCaT細胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用

表2 不同濃度JWH133作用HaCaT細胞24 h后對細胞凋亡的影響 （±s，n=3）

表2 不同濃度JWH133作用HaCaT細胞24 h后對細胞凋亡的影響 （±s，n=3）

注：與陰性組相比，aP＞0.05；與溶媒組相比，bP＜0.05

組 別 凋亡率（%）陰性組 4.34±0.07溶媒組 4.79±0.06 a 15 μmol/L 12.07±0.21 b 30 μmol/L 18.13±0.21 b 60 μmol/L 21.77±0.40 b

通過抗體芯片檢測技術篩查與銀屑病相關的細胞因子后發(fā)現（圖2、3），HaCaT細胞經TNF-α誘導后 IL-19、IL-22、IL-23、瘦素（leptin）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、單核細胞趨化因子（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN或 CD147）表達均有不同程度增加，其中IL-19表達明顯增加，JWH133處理TNF-α誘導后的各細胞因子總體表達量下降，其中IL-19、IL-22、IL-23、leptin、LIF、MCP-1、MIF表達均低于陰性組中相對應的細胞因子表達量。通過雙抗體夾心ELISA法進一步驗證其結果的可靠性，結果見表3。陰性組中IL-19、IL-22、IL-23均有微量的分泌，分別為（53.269±9.439）pg/ml、（28.676±2.667）pg/ml、（19.695±3.668）pg/ml，經 TNF-α 誘 導 后 3種因子分泌不同程度的增加，分別為增加至（88.800±16.064）pg/ml、（49.994±5.214）pg/ml、（25.584±1.987）pg/ml，加入 30 μmol/L JWH133作用后均抑制了這3種因子的分泌，分別為（52.692±11.368）pg/ml、（32.147±3.452）pg/ml、（20.123±2.173）pg/ml（P均＜ 0.05），與抗體芯片檢測結果基本一致。

圖2 抗體芯片檢測有關細胞因子的表達

圖3 各實驗組有關細胞因子表達變化關系

表3 各實驗組IL-19、IL-22、IL-23水平比較 （±s，n=3，pg/ml）

表3 各實驗組IL-19、IL-22、IL-23水平比較 （±s，n=3，pg/ml）

注: a：與陰性組相比，P＞0.05；b：與TNF-α組相比，P＜0.05

組 別 IL-19 IL-22 IL-23陰性組 53.269±9.439 28.676±2.667 19.695±3.668 TNF-α組 88.800±16.064 a 49.994±5.214 a 25.584±1.987 a TNF-α+JWH133組 52.692±11.368 b 32.147±3.452 b 20.123±2.173 b F值 10.775 33.976 5.848 P值 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05

3 討論

大麻素是一類具有多種藥理活性的化合物，從結構和生物學上類似于植物大麻中提取出來的天然大麻素——四氫大麻醇（THC），這些化合物能夠在各種類型的皮膚疾病中得到應用，比如尋常痤瘡、各種皮炎、瘙癢癥、銀屑病等。大麻素化合物各種下游效應是通過大麻素受體介導，其中CB2R作為一種G蛋白偶聯受體，主要表達于多種免疫細胞和組織，也表達于皮膚的角質形成細胞，參與細胞增殖、凋亡和免疫調節(jié)功能。JWH133是一種合成的CB2R激動劑，與其受體結合在細胞增殖、免疫調節(jié)方面能產生負性效應，由于該化合物具有特異性高且無成癮的特點，近年來已廣泛應用于抗腫瘤以及抑制炎癥反應的研究[3]。在模擬治療小鼠黑素瘤的實驗中，在體內和體外激活CB2R均能抑制腫瘤的生長，這可能是通過抑制Akt的活化來促進視網膜母細胞瘤抑制蛋白（retinoblastoma protein，pRb）磷酸化，從而使細胞周期停滯于G1～S期[4]。Bettiga等[5]認為，CB2R激活后能夠通過下調Akt表達，使其下游caspase3活化的機制誘導了膀胱癌細胞株的凋亡。本實驗采用CCK-8法檢測JWH133對HaCaT細胞體外增殖產生了抑制作用，體現了JWH133對HaCaT細胞抑制的時間和濃度依賴特性。流式細胞術檢測結果表明，不同濃度JWH133均能誘導HaCaT細胞的凋亡。筆者推測，在檢測細胞增殖、凋亡實驗中Akt信號通路可能成為JWH133作用的一個共同靶點。

TNF-α是在炎癥反應過程中扮演了多種信號通路激活的激發(fā)者，被認為是銀屑病等炎癥性疾病的發(fā)病機制中起到非常重要作用的細胞因子之一[6]。在本實驗中，通過TNF-α處理體外培養(yǎng)的HaCaT細胞誘導類似銀屑病角質形成細胞的炎癥模型。抗體芯片檢測技術具有高通量、高敏感度、平行性，能比較準確地反映蛋白質表達水平變化等特點，目前已成為定性和定量檢測生物樣品中蛋白質分子的重要檢測手段之一[7]?？贵w芯片檢測結果顯示，JWH133能不同程度抑制由TNF-α誘導的HaCaT細胞中IL-19、IL-22及IL-23的表達，且通過ELISA法驗證了芯片檢測結果的可靠性（P均＜0.05）。筆者推測JWH133可能通過CB2R/JNK及CB2R/STAT3信號通路直接或間接下調IL-23及IL-22的表達，而IL-23和IL-22的抑制又能減少IL-19的產生。IL-19是IL-10家族的細胞因子之一，IL-19能夠在角質形成細胞、內皮細胞、巨噬細胞、B細胞中表達，通過與其受體復合物（IL-20Rα/IL-20Rβ）的結合導致下游STAT3的激活，可直接引起角質形成細胞的增殖和異常分化以及細胞因子的表達。另外，角質形成細胞產生的IL-19也能夠上調CD8+T細胞產生角質形成細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）促進角質形成細胞的增殖[8]。IL-22也是IL-10家族成員之一，具有與IL-19相似的序列和結構的特征，IL-22能誘導角質形成細胞產生IL-19，在銀屑病患者皮損處以及血清中發(fā)現IL-22過量表達，并且同樣是激活下游的STAT3 形成銀屑病的發(fā)病機制。全基因組關聯分析研 究（genome-wide association studies，GWAS） 表明，即在銀屑病有關細胞因子網絡中，IL-22對銀屑病皮損的作用通過IL-17和TNF-α的協同作用進一步增強。IL-23是由p19和p40組成異源二聚體細胞因子，能夠激活JAK/STAT3信號通路增加IL-22的表達，在IL-23依賴性皮膚炎癥和表皮增生模型中，IL-23能誘導小鼠皮膚IL-19表達，這3種因子之間相互聯系，形成級聯放大效應共同參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展[9,10]。Correa等[11]用N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）能夠通過JNK MAPK信號通路抑制LPS/IFN-γ誘導的人神經小膠質細胞株中IL-23的表達，這些作用部分由CB2R激活介導的。最新研究發(fā)現，GPCRs與STAT3之間可能形成一種信號級聯參與腫瘤相關分子的轉錄調節(jié)[12]。另外，有大量相關文獻記載，leptin、LIF、MCP-1、MIF、CD147這些炎性因子均能參與銀屑病的病理過程[13-17]，本研究抗體芯片檢測結果表明，在HaCaT細胞中能被TNF-α誘導表達增加的這些免疫分子可被JWH133不同程度地抑制。由此可見，銀屑病不是單一某個因素作用的結果，而是一種免疫介導、多基因作用又相互聯系的復雜性皮膚疾病。

綜上所述，大麻素2型受體激動劑JWH133能抑制HaCaT細胞體外增殖，促進細胞凋亡，且在TNF-α誘導形成的銀屑病炎癥模型下能夠抑制IL-19、IL-22及IL-23的 分 泌， 可 能 下 調leptin、LIF、MCP-1、MIF、CD147一些重要免疫分子的表達。本文對JWH133在HaCaT細胞中作用的研究處于一個初步探索的階段，存在一定的局限性，但其今后能否成為治療銀屑病的藥物尚需要進一步研究。