黃培成，楊 強，程小耕，高秀容，文 燕，張玉琴

0 引言

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，可通過誘導細胞凋亡造成嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)并發(fā)癥，甚至導致死亡，已成為臨床手足口病的常見和危重的病原體[1-2]。近年來，EV71爆發(fā)流行仍呈上升的趨勢，目前尚無特效的藥物，只能對癥治療。因此,探求特異性抗 EV71 病毒藥物迫在眉睫。

傳染性疾病在中醫(yī)學上屬于“時疫”、“溫病”的范疇，主要采取清熱、解毒的治療原則。金銀花、連翹作為清熱解毒的常用藥對，現(xiàn)代研究表明其具有抗炎、抗菌、抗病毒、解熱等藥理活性，廣泛應用于臨床[3-5]。據(jù)不完全統(tǒng)計，上市的中成藥中含有“銀翹”藥對(Floslonicerae-fructusforsythiaeherb couples，F(xiàn)-FHC)的處方超過120個，涉及的相關(guān)制劑460多個，如雙黃連、銀翹膠囊、金地藍消毒片、復方芩蘭口服液等。此外，在手足口病診療指南(2018年版)中，F(xiàn)-FHC作為常用藥物多次被提及。鑒于此，本文結(jié)合體內(nèi)體外初步評價F-FHC抗EV71的作用。

1 材料與儀器

1.1 藥品和試劑 金銀花、連翹購于成都市荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學王光志教授鑒定，符合《中國藥典》2015年版一部金銀花、連翹項下有關(guān)規(guī)定。利巴韋林片(湖南正清制藥集團股份有限公司，批號：1807106)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青霉素和鏈霉素均購自美國Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)和甲基偶氮唑藍(MTT)購自上海生工生物工程公司。

1.2 試驗動物、細胞及病毒 SPF級1周齡KM乳鼠，雌雄各半，體重(20±2)g[成都達碩實驗動物有限公司，動物合格證號:SCXK(川)2015-030]。室溫維持在(24±2)℃，自由攝食與飲水，適應2 d后進行實驗。人子宮頸癌細胞(Hela)(上海生命科學院細胞庫)；EV71由四川省疾控中心惠贈。

1.3 試驗儀器 CO2培恒溫養(yǎng)箱(HF90，上海力申科學儀器有限公司)；BH2熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯光學儀器公司)；PHOMO酶標儀[安圖實驗儀器(鄭州)有限公司]。

2 方法

2.1 F-FHC提取物的制備 取金銀花、連翹(質(zhì)量比金銀花∶連翹=1∶1)各50 g，加10倍量的水，煎煮2次，每次1 h，過濾后合并濾液，并濃縮至1 g/ml(按生藥計)，0.22 μm微孔濾膜過濾，滅菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 EV71病毒TCID50測定 取Hela細胞(1.0×104個/ml)接種于無菌96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，放置35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中24 h，待細胞長成單層后，吸取上清液。將病毒按10-1～10-8依次稀釋，每孔100 μl接種在96 孔板上，每個濃度設(shè)8個復孔，前后左右輕搖幾下，同時另設(shè)正常細胞對照和空白對照，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及變化，并記錄，計算病毒液的半數(shù)感染濃度(TCID50)。

2.3 細胞Hela毒性實驗(MTT法)[6]取Hela細胞(1.0×104個/ml)接種于無菌96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，放置35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中24 h，待細胞長成單層后，吸取上清液。用培養(yǎng)液將藥物按2倍比稀釋7個濃度梯度，依次接種于96孔板中，每個藥物濃度4孔，并設(shè)不加藥物細胞和培養(yǎng)液空白為對照，于35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育。48 h后，吸盡培養(yǎng)液，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，繼續(xù)孵育4 h，用移液槍慢慢吸取上清液，加入DMSO 150 μl，輕輕振蕩使其溶解。用酶標儀測定490 nm處的OD值，計算F-FHC對RD細胞的半數(shù)有毒濃度(TC50)。

2.4 藥物不同處理方式體外抗病毒評價[7]評價內(nèi)容分為同時加病毒和藥物組(A組)及病毒感染后加藥組(B組)。用“2.2”項下方法在96孔培養(yǎng)板中接種和培養(yǎng)單層細胞24 h后，A組：不同濃度的藥物與100 TCID50的EV71混合，于37 ℃作用 2 h，隨后加入 96 孔板培養(yǎng) 48 h；B組：加入100 TCID50的EV71，輕混，35 ℃吸附1.5 h后，加入不同濃度的藥物，繼續(xù)孵育48 h。各孔加液量、培養(yǎng)條件、MTT法等內(nèi)容同“2.2”項，最終計算藥物半數(shù)有效濃度(IC50)。

2.5 藥物體內(nèi)抗病毒評價 取KM乳鼠若干，雌雄各半，經(jīng)腹腔注射20 μl EV71，通過嬰兒電子體溫計檢測到體溫上升和部分取血ELISA試劑盒檢測到病毒呈陽性，說明造模成功[8]。感染后小鼠隨機分為病毒對照組、利巴韋林組(2 mg/ml)以及F-FHC高、中、低劑量組[按生藥計，分別為3.0、1.5、0.75 g/(kg·d)]，并設(shè)正常對照組(未注射EV71)，每組10只。

造模成功4 d后，各給藥組連續(xù)灌胃10 d，每天1次，病毒對照組和正常對照組則灌胃給予等體積的生理鹽水。觀察動物癥狀體征的變化及死亡率，并記錄每日體重、體溫。在10 d后，小鼠脫頸處死，剖腹取出心臟，放入體積分數(shù)10%福爾馬林溶液中固定。用常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，制備成病理切片，光鏡下觀察心臟組織病理學變化情況。

3 結(jié)果

3.1 藥物細胞毒性評價 采用Reed-Muench法計算EV71 TCID50為10-3.23/ml，在后續(xù)實驗中用100 TCID50作為病毒液濃度。由圖1可知，F(xiàn)-FHC對Hela細胞的細胞毒性隨濃度的減小平行減弱。當濃度為1/64(15.6 mg/ml)時，細胞存活率接近100%，此濃度可作為體外抗病毒評價的最高給藥濃度，而TC50為123.3 mg/ml，因此，F(xiàn)-FHC的安全范圍很廣。

圖1 F-FHC對Hela細胞的毒性作用

3.2 不同處理方式體外抗EV71作用 由表 1 可知，F(xiàn)-FHC不同方式處理EV71 孵育48 h 后，均可提高Hela細胞的存活率，對病毒產(chǎn)生一定的抑制作用，并呈現(xiàn)出一定程度上的劑量依賴關(guān)系。此外，A組的IC50為8.65 mg/ml，B組的IC50為12.17 mg/ml，說明F-FHC對EV71的直接抑制作用強于治療作用。由圖2可見，正常細胞組(圖2A)活細胞數(shù)目較多，生長情況良好，細胞體積較大，比較均一。感染EV71后(圖2B)活細胞數(shù)目明顯減少，細胞形態(tài)逐漸變圓變小，細胞質(zhì)濃縮，出現(xiàn)死亡。但無論哪種處理方式，給予F-FHC處理后，活細胞數(shù)目明顯增多(圖2C)。

表1 F-FHC不同處理方式對EV71的抑制作用

3.3 體內(nèi)抗EV71作用

3.3.1 一般體征觀察 感染后的第3天，所有小鼠均出現(xiàn)低熱、精神萎靡、活動減少、拒食、體重下降，說明造模成功。病毒對照組感染第5天后逐漸伴有豎毛、弓背、體型減小等癥狀，感染第7天出現(xiàn)嗜睡、死亡率明顯上升。而不同濃度的F-FHC治療后各種癥狀都有所緩解，特別在治療4 d后，體重開始回升，治療10 d后，中、高劑量組與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義，效果接近利巴韋林。低劑量組出現(xiàn)了部分小鼠死亡。

3.3.2 組織鏡檢 由圖3可知，正常對照組心肌組織未見炎性細胞浸潤及壞死灶，細胞排列整齊，呈圓柱狀，胞核卵圓，位于細胞中央(圖3A)。而病毒對照組心臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了部分紊亂，伴有炎癥細胞浸潤，但未見明顯組織壞死(圖3B)。F-FHC中、高劑量組與利巴韋林組效果類似，心臟組織形態(tài)與正常對照組無明顯差別。

4 討論

手足口病主要是由EV71和柯薩奇病毒A組16型(CV-A16)等腸道病毒引起的，多見于學齡前兒童。該病主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、手足部發(fā)生紅色斑丘疹、口腔黏膜等部位潰瘍，嚴重者可引起腦干腦炎及神經(jīng)源性肺水腫[9-10]。由于其隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快，在短時間內(nèi)可造成較大范圍的流行，已按丙類傳染病管理。目前，手足口病診療指南和治療方案日趨成熟，病死率也得到了有效控制，但如何有效地縮短病程、減輕臨床癥狀、提高總體療效等尚不明確。西醫(yī)綜合治療方案包括足量激素抗炎、甘露醇脫水保護腦細胞、免疫球蛋白提高免疫力以及對癥支持治療。臨床療效觀察顯示，該方案既有優(yōu)勢，也有自身局限性，包括退熱效果不理想、重癥患者病程時間仍然較長、使用免疫球蛋白經(jīng)濟壓力大等[11]。隨著研究的深入，中醫(yī)藥防治手足口病的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。

圖2 F-FHC不同處理方式對 EV71 的抑制作用

圖3 心臟組織病理形態(tài)學(200×)

EV71是引起手足口病重癥病例的主要因素[12]，危害極其嚴重，已受到社會廣泛關(guān)注。EV71 無包膜，對去污劑、乙醚、脫氧膽酸鹽及弱酸處理不敏感，且 EV71 在病毒復制過程中易產(chǎn)生突變[13]，給EV71 的預防及治療造成了極大的困難。目前，臨床上普遍使用利巴韋林、阿昔洛韋等廣譜的抗病毒藥物。這些藥物雖然對癥狀有所緩解，但毒副作用明顯，針對性不強，安全性不高[14-15]。臨床上仍缺乏特效的、專一的、機制明確的抗 EV71藥物。許多單味中藥和復方通過直接抑制病毒復制、增強宿主免疫功能、抗炎等多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)的共同作用機制，在抗病毒方面已顯示出了獨特的優(yōu)勢，如甘露消毒丹、雙黃連、升麻葛根湯等[16-17]。

中醫(yī)認為，手足口病乃由外感時邪、濕熱內(nèi)蘊、內(nèi)外熏蒸、郁結(jié)肌表而成，屬于溫病的范疇。金銀花、連翹均有清熱解毒功效，二者同用效果更強更專，已廣泛用于抗SARS病毒和甲流H1N1等傳染病中，收效甚佳[18]?，F(xiàn)代研究表明，二者均有抗菌、抗炎、抗病毒、增強機體免疫力等藥理作用，合用藥效更好[19-20]。本試驗結(jié)合體內(nèi)體外的方法初步確定了F-FHC抗EV71的作用，并呈現(xiàn)出一定程度上的劑量依賴關(guān)系。體外不同方式處理試驗中發(fā)現(xiàn)，同時加入藥物和病毒組比感染后加藥物組的作用更強，可能是由于F-FHC阻止了病毒對細胞的吸附和傳入，防止由感染細胞向未感染細胞侵染，并兼有一定的直接殺滅作用。體外實驗表明；F-FHC能改善感染小鼠的體征和心臟病理變化，可能與增強宿主的免疫力有關(guān)。此外，臨床研究顯示，將F-FHC配伍的中藥與西藥聯(lián)合使用，往往效果更佳[21]。