李佳慧 ，楊芳芳 ，王珍 ，張賽南 ，王首鋒 ，3*

（1.浙江大學基礎醫(yī)學系，浙江杭州310058；2.綠城農科檢測技術有限公司，浙江杭州310052；3.浙江省微生物生化與代謝工程省級重點實驗室，浙江杭州310058）

谷胱甘肽是一種由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的活性三肽，分子式為C10H17O6SN，相對分子質量為307.33，熔點為189～193℃。谷胱甘肽分別以還原性谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)形式存在，但在人體內主要為前者。結構決定功能，正是由于其側鏈上有一個活潑巰基，能夠在生物體內參與許多氧化還原反應，使得谷胱甘肽具有多種生理功能，因此其應用領域也十分廣泛。

目前，生產谷胱甘肽的方法有溶劑提取法、化學合成法、發(fā)酵法以及酶法。在大多數(shù)細胞及革蘭氏陰性菌中，谷胱甘肽的合成分2步[1]：第1步，在γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(γ-GCS,大腸桿菌中由基因gshA編碼，在酵母中由GSHI編碼)的作用下，將L-谷氨酸與L-半胱氨酸合成谷氨酸半胱氨酸；第2步，在γ-谷胱甘肽合成酶(GS，大腸桿菌中由gshB編碼，在酵母中由GSHII編碼)的作用下，將谷氨酸半胱氨酸合成谷胱甘肽。然而，當體內GSH含量較高時，就會與γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶結合，從而降低了GSH的合成與積累。LIAO等[2]通過構建同時含有gshA和gshB基因的重組大腸桿菌，經過表達發(fā)現(xiàn)，GSH質量濃度為34.8 mg·L-1，較之前有很大提高。LI等[3]采用2種方法合成谷胱甘肽，一種是在含3種氨基酸和葡萄糖（通過糖酵解提供ATP）的條件下表達酵母細胞，對其生成谷胱甘肽的過程不進行人為干預；另一種是嚴格控制第1步反應中生成的谷氨酸、半胱氨酸的產量，并加入能恰好消除反饋抑制過程的甘氨酸。結果表明，后者所產谷胱甘肽產量為前者的1.5倍左右。這些均說明谷胱甘肽生成過程中的反饋抑制是可以被降低甚至消除的。

近年來，在一些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)了一種依賴ATP，能催化谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽，同時具有谷氨酸、半胱氨酸合成酶與谷胱甘肽合成酶活性的新型酶，即新型雙功能谷胱甘肽合成酶GshF。這些細菌主要有Streptococcus agalatiae[4], Streptococcusthermophiles[3], Listeria monocycogenes[5],Pasteurella multocida[6]等。在后2種細菌中，GshF的活性同樣受到GSH的反饋抑制。目前，雖已將利用基因改造高產菌株與傳統(tǒng)兩步法結合進行GSH工業(yè)化生產，但仍存在成本較高和反饋抑制等問題，因此，對新型雙功能谷胱甘肽合成酶的研究十分重要，其在未來GSH的工業(yè)化生產中具有良好的前景。

已有較多實驗從Streptococcus thermophiles中克隆目的基因并構建重組表達載體，且GshF表達量較兩步法高。劉曉冬[7]從Streptococcus agalatiae中克隆得到目的基因gshF后構建重組表達載體pET-gshFSA，經IPTG誘導表達、超聲破胞等處理后測得酶活為0.127 5 U·mg-1。YANG等[8]也從Streptococcus thermophiles中擴增目的基因gshF并構建原核表達載體，然后用IPTG進行誘導表達。迄今，對新型雙功能谷胱甘肽合成酶的報道不多，現(xiàn)有報道中多見通過構建原核表達載體對目的基因gshF進行誘導表達。因此，本實驗選擇從Streptococcus agalatiae中克隆目的基因gshF，再分別將其構建到畢赤酵母和大腸桿菌2種表達載體中，得到重組質粒，分別對這2種重組表達載體進行誘導及酶活測定，最后比較表達產物GshF的酶活大小，選擇最適宜且最高效的表達方式，為以后工業(yè)生產GSH奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與材料

無乳鏈球菌(Streptococcus agalatiae)購自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司；畢赤酵母GS115，表達載體pPIC9K，質粒pET-28a，大腸桿菌E.coil BL21為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，瓊脂粉15(配制固體培養(yǎng)基時加入)，使用前加入相應的50 mg·L-1卡那霉素。YPD培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，瓊脂粉20(配置固體培養(yǎng)基時加入)。MD培養(yǎng)基：1.34%酵母基本氮源，4×10-5%生物素，2%葡萄糖，1.5%瓊脂。BMGY培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol·L-1磷 酸 鉀 (pH 6.0)，1.34%YNB，4×10-5%生物素，1%丙三醇。BMMY培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol·L-1磷酸鉀(pH 6.0)，1.34%YNB，4×10-5%生 物素 ，0.5% 甲 醇 。Todd-Hewitt肉湯(THB）培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉粉 10，胰蛋白胨20，葡萄糖2，碳酸氫鈉2，氯化鈉2，磷酸氫二鈉0.4。

1.1.3 工具酶與試劑

高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)、Taq DNA 聚合酶、SnaB I、Not I、Sal I限制性內切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒小量抽提試劑盒購自Axygen公司；PCR產物純化試劑盒、T4 DNA連接酶試劑盒、割膠純化試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Bradford蛋白定量試劑盒購自BIOMIGA公司。

谷胱甘肽還原型、二硫代雙硝基苯甲酸［5，5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB］、丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺、G418硫酸鹽、考馬斯亮藍R-250、蛋白中分子量marker、50×TAE核酸電泳緩沖液購自生工生物工程(上海)有限公司;測序與引物合成送至生工生物工程(上海)有限公司;試劑和混合溶液的配制方法均參考文獻[9]。

1.2方法

1.2.1 試驗材料的準備

將購買的凍干標準無乳鏈球菌(Streptococcus agalatiae)菌種進行復蘇，全程均在超凈工作臺中進行。首先打開凍干菌株瓶并用蘸取75%酒精的棉球擦拭瓶口及瓶身；然后往里加入500 μL標準菌株復溶液，混勻后用接種環(huán)挑菌液直接劃到THB平板上，37℃培養(yǎng)。

1.2.2 gshF基因克隆

根據TaKaRa公司的MiniBESTBacteriaGenomic DNAExtraction試劑盒，從無乳鏈球菌(Streptococcus agalatiae)中提取基因組DNA。

根據GenBank公布的新型雙功能谷胱甘肽合成酶基因序列(EFV98076)以及畢赤酵母和大腸桿菌表達載體上多克隆位點的特征，分別設計引物對F1/R1和 F2/R2(見表 1)。其中引物 F1含有 SnaB I酶切位點（下劃線部分），引物R1含有Not I酶切位點（下劃線部分）；引物F2含有Not I酶切位點（下劃線部分），引物R2含有Sal I酶切位點（下劃線部分）。以提取的基因組DNA為模板，分別以F1/R1和F2/R2為引物進行PCR反應以擴增目的基因gshF。PCR 反 應 體 系(50 μL)：TaKaRa PrimeSTAR Max Premix(2× )25 μL，正 反 向 引 物 (10 μmol·L-1)各0.5 μL，上述模板 1 μL，H2O 23 μL。

表1 引物Table 1 Primers

PCR擴增程序如下：

隨后對PCR產物gshF進行檢測與割膠回收。

1.2.3 表達載體pPIC9K-gshF與pET-gshF的構建、轉化與檢測

本研究采用雙酶切的方法將目的基因克隆到表達載體上。由引物對F1、R1擴增得到的目的基因gshF用限制性內切酶SnaB I和Not I雙酶切處理后，連接到用相同酶處理的質粒pPIC9K上，得到重組質粒pPIC9K-gshF；將以F2、R2為引物擴增得到的gshF用限制性內切酶Sal I和Not I雙酶切后連接到經同樣處理的pET-28a上，得到重組質粒pET-gshF。分別熱擊轉化至提前制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21后，在含100 μg·mL-1卡那霉素的平板上篩選陽性轉化子。

用Sal I限制性內切酶線性化處理構建好的pPIC9K-gshF與空載體pPIC9K，經PCR產物純化后電轉至畢赤酵母GS115中。同時電轉空載體pPIC9K作陰性對照。

采用MD平板篩選His＋轉化子。將重組轉化子用高壓滅菌水洗，將其分別涂在含0.25，1.0，2.0，4.0 mg·mL-1G418的YPD平板上，進行多拷貝重組菌株篩選[11]。

1.2.4 多拷貝轉化子的篩選與鑒定

分別從 0.25，1.0，2.0，4.0 mg·mL-1G418抗性的YPD平板上挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)過夜，取200 μL離心棄上清。再用等體積無菌水洗3次后，取1 μL作為模板進行PCR擴增。經瓊脂糖凝膠電泳驗證，最終從4.0 mg·mL-1G418抗性YPD平板上鑒定出陽性單克隆。

陽性重組載體pET-gshF可直接誘導表達。

1.2.5 重組酵母GS115/pPIC9K-gshF的誘導表達

將上述陽性重組酵母接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃過夜震蕩培養(yǎng)。按1%接種量轉入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r·min-1，搖菌培養(yǎng)至OD(600 nm)＝2～6。室溫下3 000 r·min-1離心5 min后棄上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體至OD(600 nm)＝1后誘導表達蛋白GshF。期間，每12 h取5 mL培養(yǎng)液且補加無水甲醇至終體積分數(shù)為2%。96 h后，收集發(fā)酵液，同之前不同時段取出的菌液一起離心，條件為10 000 r·min-1，離心10 min。用三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)對上清液脫鹽處理后，進行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 重組大腸桿菌BL21-pET-gshF的誘導培養(yǎng)與破胞

從平板上挑單菌落于含有卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)過夜，然后取1%培養(yǎng)液轉接至50 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，同條件培養(yǎng)1.5 h后，加入過濾除菌的IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，繼續(xù)同條件培養(yǎng)7 h后，12 000 r·min-1離心后收集菌體[9]。

用 20 mmol·L-1的 Tris-HCl(pH8.0)重 懸 菌體，5 000 r·min-1，離心 10 min，洗滌 3 次。最后將菌體重懸在 10 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)，在冰浴中對菌懸液進行超聲破胞，破碎條件為：功率200 W，5 s脈沖，7 s停息，共 40次。最后 8 000 r·min-1離心25 min后去掉沉淀，收集粗酶液。

1.2.7 蛋白質量的測定

采用Bradford方法和紫外分光光度法測定[11]。

1.2.8 重組酵母及大腸桿菌表達產物酶活性測定

由于新型雙功能谷胱甘肽合成酶可以催化谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽，谷胱甘肽可由DTNB［5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)］法測定，且在412 nm具有特征吸收值，因此，可以通過測定吸光值來表征GshF的酶活。酶活測定：采用1 mL反應 體 系 ：0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，40 mmol·L-1Glu，20 mmol·L-1Cys，40 mmol·L-1Gly，100 μL GshF，20mmol·L-1MgCl2，40mmol·L-1ATP，反應液在37℃水浴下反應20 min，取出500 μL與等體積的20%TCA混勻，再在冰上放置30 min后，12 000 r·min-1離 心 10 min，收 集 上 清 測 定 GSH濃度[12-13]。

采用DTNB法測定谷胱甘肽含量。取上述反應所得待測GSH 0.5 mL加入1.5 mL 0.15 mol·L-1的NaOH溶液中，搖勻，再加入3%甲醛溶液（消除Cys的干擾），搖勻并靜置2 min。取0.5 mL上述混合液并加入2.5 mL DTNB分析液，搖勻，25℃水浴保溫5 min。然后以水為空白對照，測定在波長412 nm處的吸光值[14]（DTNB分析液由1體積0.01 mol·L-1DTNB 溶 液 加 100體 積 0.25 mol·L-1(pH 8.0)的Tris-HCl緩沖液配制而成）。從谷胱甘肽的標準曲線上得到對應的GSH濃度，然后計算GshF酶活。

酶活力單位（U）定義為每分鐘產生1 nmol谷胱甘肽所需的GshF酶量，用體積比酶活(U·mL-1)來衡量。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析

gshF基因可編碼750個氨基酸，蛋白相對分子質量為85 595.51，等電點為5.44。

2.2 gshF基因的克隆

以直接提取的Streptococcus agalatiae基因組DNA為模板，分別利用2對引物和PrimeSTAR Max Premix(2×)擴增目的基因。1%瓊脂糖凝膠檢測顯示，在2 200 bp左右有1目的條帶，與預期大小一致（見圖1）。將目的片段分別連接在質粒pPIC9K和pET-28a上后送去測序。測序結果顯示，擴增得到的gshF與報道的來源于Streptococcus agalatiae ATCC13813的同源性達100%。

2.3 表達載體pPIC9K-gshF和pET-gshF的構建

將目的基因片段gshF分別用相應的限制性內切酶酶切后，連接到用相同限制酶酶切的質粒pPIC9K和pET-28a上，連接產物再熱擊轉化入BL21。重組載體構建完成后再用相應的限制酶雙酶切，電泳檢測顯示，得到約2 200 bp大小的片段（見圖2），與預期值相符。

圖1 gshF基因的PCR擴增產物Fig.1 PCR product of gshF gene 1：DL5000DNA 標志物；2：gshF基因PCR產物（模板為F1/R1）；3：gshF基因PCR產物（模板為F2/R2）1：DL5000DNA marker；2：Amplified PCR product of gshF（F1/R1Primer）；3：Amplified PCR product（F2/R2Primer）

圖2 重組表達載體pPIC9K-gshF和pET-gshF菌落PCR陽性鑒定Fig.2 The PCR positive identification of pPIC9K-gshF and pET-gshF

2.4 表達載體pPIC9K-gshF的轉化與篩選

在將pPIC9K-gshF電轉到GS115之前，先用Sal I對其線性化處理。電轉至GS115后，用MD平板篩選，結果如圖3所示。平板MD-SA為重組載體電轉至GS115后所得的重組子，平板MD-pPIC9K為陰性對照。MD-SA上的重組子再分別經含不同濃度G418的YPD平板篩選，最后篩選出對4.0 mg·mL-1G418有抗性的多拷貝重組菌株（見圖3）。

圖3 重組酵母的G418抗性平板篩選Fig.3 Screening result of G418 resistant plates of recombinant yeast

2.5 重組酵母GS115/pPIC9K-gshF菌落PCR鑒定

用牙簽蘸取上述多拷貝單菌落，在10 μL無菌水中震蕩后，100℃加熱5 min，可直接將其作為模板。用F1、R1(見表1)為引物進行PCR鑒定，如圖4所示，在2 200 bp處出現(xiàn)目的條帶。

圖4 重組gshF抗性酵母菌株菌落PCR陽性鑒定結果Fig.4 Positive identification result of colony PCR of recombinant gshF resistant yeast strain

2.6 重組畢赤酵母甲醇誘導表達

從含4.0 mg·mL-1G418的YPD平板上挑取經PCR鑒定的單菌落，根據Invitrogen公司Pichia expression kit表達說明書，重組菌株以2%甲醇、30℃誘導表達96 h，每12 h取樣并添加無水甲醇至終體積分數(shù)為2%。離心收集上清液，再經TCA沉淀后，進行SDS-PAGE分析。考馬斯亮藍染色后檢測各發(fā)酵時間的蛋白表達量(見圖5)。從圖5可見，在12 h處表達量最高，且在約85 kDa處均有特異性條帶，與預期相對分子質量大小相符。

圖5 發(fā)酵上清蛋白SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of fermentation supernatant protein

2.7 重組大腸桿菌IPTG誘導表達

從新鮮平板上挑取鑒定過的重組菌株BL21-pET-gshF于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉接于新的含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5 h，再加入IPTG誘導培養(yǎng)7 h。離心收集菌體，用20 mmol·L-1的 Tris-HCl(pH 8.0)重懸并對其超聲處理。經SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍染色后，蛋白表達結果如圖6所示。

圖6 超聲破碎前后蛋白SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of protein before and after ultra-sonication

2.8 Bradford法測定蛋白含量

按表2所示在不同編號的試管中加入蛋白標準溶液、蒸餾水與Bradford染色液?；靹蚝箪o置10 min，測定各管溶液的OD595并以標準蛋白溶液濃度和OD595為橫縱坐標繪制標準曲線(見圖7)，線性回歸方程為y＝0.089 1x，R2=0.966 2。

取GS115/pPIC9K-gshF發(fā)酵表達上清與BL21-pET-gshF誘導表達破壁上清各50 μL加入試管中，再加50 μL蒸餾水。隨后加入3 mL Bradford染色液，混勻，室溫放置10 min后用紫外分光光度儀測定595 nm處的吸光度。按照標準曲線計算蛋白濃度。其中，GS115/pPIC9K-gshF發(fā)酵表達中上清蛋白質量分數(shù)為0.46 mg·mL-1，BL21-pET-gshF誘導表達破壁上清中蛋白質量分數(shù)為1.46 mg·mL-1。

2.9 谷胱甘肽的檢測

精確配制濃度為 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g·L-1的GSH標準溶液，按照1.2.8節(jié)方法測定。以GSH濃度為橫坐標，對應的OD412值為縱坐標，繪制標準曲線。所得谷胱甘肽標準曲線如圖8所示，線性回歸方程為 y＝1.081x，R2=0.953 5。

通過測定2種不同表達方式所得GshF酶催化生成的谷胱甘肽在412 nm處的吸光值來計算GshF的酶活，結果見表3。

表2 Bradfrod法測定蛋白所需標準品Table 2 Standards for Bradford

圖7 Bradford法測定蛋白標準曲線Fig.7 The standard curve of protein by Bradford

圖8 谷胱甘肽的標準曲線Fig.8 The standard curve of GSH

表3 不同菌株發(fā)酵表達的GshF酶活分析Table 3 Analysis enzyme activity in different strains

3 討 論

GSH是一種具有多種生理功能的重要物質，且市場需求量巨大，主要應用在：(1)食品行業(yè)。在酒類中添加GSH可維持酒的風味，在面包等中加入GSH可使其保持色澤，加入肉制品中則可維持肉制品的新鮮度等。(2)化妝品行業(yè)。利用GSH可清除氧自由基，具有抗氧化等功效，還可用來制備美白產品等。(3)醫(yī)藥行業(yè)?？梢种艸IV病毒，也可作為抗癌藥物等。GSH純品及其衍生品在全球的銷量預計超90億元[15]，因此，降低成本、減少產物抑制顯得十分重要。除了在原有兩步法生成GSH途徑上進行優(yōu)化外，還可深入研究新型雙功能谷胱甘肽合成酶。

近年來，在某些菌中發(fā)現(xiàn)了一種同時具備GSH I和GSH II酶活性的新型雙功能谷胱甘肽合成酶，且GSH對其不具有反饋抑制作用。與傳統(tǒng)兩步法生成GSH相比，該方法簡化了生產步驟、降低了成本。因此，新型雙功能谷胱甘肽合成酶在未來GSH的生產中具有非常好的前景。

常用的表達系統(tǒng)有大腸桿菌與畢赤酵母2種。這2種表達系統(tǒng)各有特點，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有生長繁殖快、培養(yǎng)簡單、成本低、周期短、表達高的優(yōu)點，能在較短時間內獲得表達產物，但常須對產物進行破胞與純化，且不具有翻譯后修飾功能。畢赤酵母表達系統(tǒng)是最有效的外源蛋白表達體系之一，該系統(tǒng)不但可對表達產物進行加工修飾，使表達的重組蛋白更接近天然蛋白的構象；而且還具有分泌功能，能夠將表達產物直接分泌至胞外，減少后期純化的成本。其高密度發(fā)酵生長的特性更適合蛋白的工業(yè)化生產。

本實驗從無乳鏈球菌Streptococcus agalatiae中克隆目的基因gshF，利用基因工程的手段構建表達載體pPIC9K-gshF與pET-gshF，然后分別轉化到畢赤酵母GS115和大腸桿菌BL21中表達。比較2種不同表達方式所得的GshF酶活，發(fā)現(xiàn)GshF更適合在大腸桿菌中表達，且比酶活可達62.15 U·mL-1，而在畢赤酵母表達中的比酶活僅為14.15 U·mL-1。本實驗和已有文獻的結果表明，gshF可在重組大腸桿菌載體中高效表達，但其在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達量較低，可能因無乳鏈球菌Streptococcus agalatiae為細菌，其來源的目的基因gshF更適合在大腸桿菌系統(tǒng)中表達，但在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的密碼子具有偏好性。

因此，在后續(xù)研究工作中，會對無乳鏈球菌gshF進行更多分子生物學水平上的功能改造，如基因的密碼子優(yōu)化和利用體外定點突變的方法進行基因的酶活改造，以及后續(xù)發(fā)酵條件的優(yōu)化，尤其是對畢赤酵母發(fā)酵的溫度、pH等條件的優(yōu)化。同時，還可以利用親和層析等方法對GshF進行純化，用來合成GSH和測定其含量。所以，未來在GSH的工業(yè)化生產過程中要綜合考慮2種表達系統(tǒng)的優(yōu)劣，通過多角度優(yōu)化，降低成本，提高產量，以滿足市場需求。