金燦燦，邵世和

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

近年來，肺癌的發(fā)病率及致死率逐年上升，已成為惡性腫瘤中的“頭號(hào)殺手”。盡管目前手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療、免疫治療等治療手段不斷豐富，但肺癌5年生存率仍較低。肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多分子靶點(diǎn)、多信號(hào)通路調(diào)控的過程，其發(fā)病機(jī)制尚未明確［1］。當(dāng)前，研究重要的分子調(diào)控元件及相關(guān)信號(hào)通路，可為肺癌的發(fā)病機(jī)制研究提供有力證據(jù)。miRNA作為重要的轉(zhuǎn)錄后分子調(diào)控因子，參與調(diào)控多種生理病理過程。miRNA廣泛存在于動(dòng)植物的基因組中，本身十分保守，大部分通過與靶基因的3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)堿基配對(duì)的方式來執(zhí)行對(duì)靶基因的切割或抑制翻譯的功能，進(jìn)一步參與到包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病過程［2］。miR-129在細(xì)胞生長、發(fā)育、癌變等生命過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，在胃癌［3］、乳腺癌［4］、肝癌［5］、甲狀腺癌［6］等常見腫瘤中存在明顯的差異表達(dá)。T細(xì)胞因子4（T-cell transcription factor-4，TCF4）作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄輔助因子，其本身不能決定基因表達(dá)的開啟，與之結(jié)合的其他轉(zhuǎn)錄激活蛋白決定了它所調(diào)節(jié)的靶基因的表達(dá)狀態(tài)。TCF4參與諸多腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程，有望成為腫瘤基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-129在人肺腺癌組織中較癌旁組織表達(dá)明顯減少，證實(shí)miR-129可抑制肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，但相關(guān)的作用機(jī)制目前尚未明確。后期我們通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)miR-129存在多個(gè)TCF4 3’UTR端的結(jié)合位點(diǎn)，提示TCF4可能是miR-129的靶基因，初步指向miR-129可能通過作用于TCF4，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)下游信號(hào)通路，影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探討miR-129抑制肺腺癌細(xì)胞A549的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑及儀器

肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液（美國Hyclone公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma Scientific公司）；Opti-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；TRIzol、RT-PCR試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒（TaKaRa公司）；miR-129、TCF4、E-鈣黏蛋白、波形蛋白、β-肌動(dòng)蛋白引物（上海英駿公司）；BCA試劑盒（碧云天公司）；Tween-20（AMRECO公司）；PVDF膜（Amersham Biosciences公司）；半干轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）；預(yù)染蛋白標(biāo)志物（Fermentas公司）；兔抗大鼠E-鈣黏蛋白單克隆抗體（BD公司）；兔抗大鼠波形蛋白單克隆抗體（DAKO公司）；兔抗大鼠TCF4單克隆抗體（CST公司）；兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體（Sigma公司）；7500 Fast熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；全自動(dòng)凝膠成像儀（北京賽智公司）；ND-1000UV微量紫外分光光度計(jì)（美國Nanodrop公司）。

miR-129mimic和對(duì)照引物序列由上海吉瑪公司合成，miR-129 mimic引物上游：5′-CUUUUUGCGGUCUGGGCUUUGC-3′，下游：5′-AAGCCCAGACCGCAAAAAGUU-3′；無關(guān)序列引物上游：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞，置培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組（無關(guān)序列）、miR-129 mimic組。每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將A549細(xì)胞用0.1%胰酶消化液消化，含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，配成8×105/mL細(xì)胞懸液，分別接種于6孔培養(yǎng)板，1.5 mL/孔。用250μL不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM分別稀釋100 pmol miR-129 mimic及5μL脂質(zhì)體2000；手指輕彈管壁輕輕混勻并室溫孵育5 min后，將兩種混合液再次輕輕混勻，室溫孵育20 min。將miR-129 mimic-lipo2000混合液加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)板，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后更換含2%胎牛血清的DMEM新鮮培養(yǎng)基。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-129 mimic的轉(zhuǎn)染效率及TCF4、E-鈣黏蛋白、波形蛋白的mRNA表達(dá)水平

將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液吸干，PBS洗滌2次，用Trizol裂解細(xì)胞，抽提 RNA，用紫外分光光度儀測定260 nm/280 nm的光密度（D）值，測定RNA濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)時(shí)間將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物。引物由上海英駿公司設(shè)計(jì)并合成，以U6/GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3次。PCR反應(yīng)體系（10μL）包括SYBR Premix ExTaqTM5.0μL、DNA模版 1.0μL、ddH2O 3.6μL、PCR上下游引物（10μmol/L）各 0.2μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30 s，94℃10 s，60℃30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，進(jìn)行溶解曲線的檢測，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡檢測TCF4、E-鈣黏蛋白、波形蛋白的蛋白表達(dá)

將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液吸干，PBS洗滌2次，按1 mL裂解液加10μL PMSF（100 mmol/L），使蛋白充分裂解（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行），將裂解好的蛋白在沸水中煮15 min，于4℃下12 000 r/min離心15 min，將離心后的上清液分裝轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，置于-80℃保存。根據(jù)蛋白定量試劑盒要求定量蛋白，用酶標(biāo)儀檢測D值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。提取定量后的蛋白，各取40μg行10%SDS-PAGE分離蛋白，電壓為80 V，待溴酚藍(lán)顯示于下層膠后將電壓調(diào)至120 V，適時(shí)終止電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF膜（250 mA，70 min）。50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗（TCF4、E-鈣黏蛋白、波形蛋白抗體稀釋比均為1∶1 000），4℃孵育過夜；1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗孵育1 h，1×TBST洗膜3次；用自動(dòng)曝光儀獲得圖像。重復(fù)3次。

1.5 miR-129 mimic和TCF4 3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染

種植HEK-293細(xì)胞至24孔板，1.5×105/孔，培養(yǎng)24 h；用脂質(zhì)體2000將無關(guān)序列（陰性對(duì)照組）和miR-129 mimic（miR-129 mimic組）分別轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，RNA∶脂質(zhì)體=1.5μL∶1μL，采用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；10 h后換相同濃度培養(yǎng)液，用脂質(zhì)體2000將TCF4 3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293細(xì)胞，質(zhì)粒DNA∶脂質(zhì)體=400 ng∶1μL，轉(zhuǎn)染過夜。

1.6 Promega雙報(bào)告基因試劑盒檢測報(bào)告基因信號(hào)

每孔加入胰酶100μL消化細(xì)胞后，加入600μL含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞收集到1.5 mL離心管；1 200 r/min離心4 min，吸除上層650μL培養(yǎng)液后重懸細(xì)胞；吸取細(xì)胞懸液15μL/孔（×3復(fù)孔）加入384孔板；每孔中加入Promega雙報(bào)告基因試劑盒Ⅰ15μL，混勻；避光放置10 min，酶標(biāo)儀檢測；每孔中加入Promega雙報(bào)告基因試劑盒Ⅱ15μL，混勻；避光放置10 min，酶標(biāo)儀檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，配對(duì)資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad Prism 6.0軟件制作圖表。

2 結(jié)果

2.1 miR-129 mimic的轉(zhuǎn)染效率

miR-129mimic轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549后，光鏡下可見腺癌細(xì)胞向梭形細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化速度減緩（圖1）；實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-129表達(dá)明顯上調(diào)約339.24倍（t=0.098 4，P＜0.01）。見圖2。

圖1 miR-129 mimic轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞形態(tài)（光學(xué)顯微鏡×400）

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-129 mimic的轉(zhuǎn)染效率

2.2 miR-129 mimic轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞TCF4及E-鈣黏蛋白、波形蛋白的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-129 mimic轉(zhuǎn)染后，A549細(xì)胞miR-129靶基因TCF4 mRNA表達(dá)較陰性對(duì)照組下調(diào)約53.07%（t=0.979，P＜0.05），E-鈣黏蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)約6.09倍（t=0.998，P＜0.01），波形蛋白 mRNA表達(dá)下調(diào)約41.15%（t=0.000 4，P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，miR-129 mimic轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549后，TCF4和波形蛋白的蛋白表達(dá)下調(diào)，E-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)（圖4）。

2.3 驗(yàn)證miR-129對(duì)TCF4 3′-UTR的靶向調(diào)控作用

生物信息學(xué)分析（targetscan網(wǎng)站）顯示miR-129與TCF4存在相互結(jié)合位點(diǎn)（圖5）；將miR-129 mimic與TCF4 3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-129表達(dá)上調(diào)后，TCF4報(bào)告基因質(zhì)粒熒光素酶活性明顯降低（t=0.845，P＜0.01）。見圖6。

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測TCF4、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的m RNA表達(dá)

圖4 蛋白質(zhì)印跡檢測TCF4、E-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)

圖5 miR-129與TCF4存在相互結(jié)合位點(diǎn)

圖6 TCF4報(bào)告基因質(zhì)粒熒光素酶活性檢測

3 討論

在惡性腫瘤的發(fā)展初期，腫瘤細(xì)胞可分泌基質(zhì)降解酶等有害物質(zhì)破壞基底膜，進(jìn)而發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［8-10］。進(jìn)一步，惡性腫瘤細(xì)胞在發(fā)生轉(zhuǎn)移前及轉(zhuǎn)移時(shí)也會(huì)在相應(yīng)微環(huán)境的改變下發(fā)生EMT［11］。此時(shí)，腫瘤細(xì)胞不僅會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變，更重要的是在各種分子調(diào)控元件及信號(hào)通路的調(diào)控下，發(fā)生一系列上皮、間質(zhì)分子及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)改變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)及新的轉(zhuǎn)移瘤的形成［12-15］。研究表明，miR-129可通過抑制PDPK1的表達(dá)抑制人管狀上皮細(xì)胞的EMT［16］，也可通過抑制 H3K27m3的表達(dá)影響乳腺癌的EMT進(jìn)程［17］。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-129的表達(dá)可以使肺腺癌細(xì)胞E-鈣黏蛋白的表達(dá)增加、波形蛋白的表達(dá)降低，提示miR-129可阻遏A549細(xì)胞EMT進(jìn)程。

TCF4是EMT進(jìn)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，能促進(jìn)腫瘤的侵襲能力［18-19］。本研究結(jié)果表明上調(diào)miR-129的表達(dá)可以使TCF4的mRNA水平及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。我們進(jìn)一步利用miR-129 mimic與TCF4 3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，結(jié)果顯示TCF4報(bào)告基因質(zhì)粒熒光素酶活性降低，證實(shí)TCF4為miR-129沉默的靶基因。因此，miR-129可能是通過抑制TCF4表達(dá)，進(jìn)而抑制EMT進(jìn)程及肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miR-129可能通過抑制TCF4表達(dá)阻遏A549細(xì)胞的EMT進(jìn)程，進(jìn)而抑制肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。