王金華 黃睿 張葉青 張丹紅 柯博熙 陳富強(qiáng)

丹參多酚酸鹽B是從丹參中提取的一種水溶性酚類化合物，在丹參中含量十分豐富[1]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面，丹參多酚酸鹽B主要應(yīng)用于缺血性腦血管病的治療，具有抗氧化應(yīng)激、改善突觸可塑性、抑制凋亡等重要作用[2]；丹參多酚酸鹽B還具有改善血管性癡呆大鼠和Aβ沉積引起的癡呆鼠認(rèn)知功能的作用[3-4]。另有研究證實(shí)丹參多酚酸鹽B能通過(guò)調(diào)節(jié)血糖和脂類代謝有效治療糖尿病和肥胖性疾病[5-6]。然而，丹參多酚酸鹽B對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能是否產(chǎn)生影響，相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本研究擬觀察丹參多酚酸鹽B對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知功能的影響，并探討其具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性健康SPF級(jí)SD大鼠38只，由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供。每籠2～3只飼養(yǎng)，所有動(dòng)物均可隨意進(jìn)食水。室內(nèi)溫度控制在21～25°C，動(dòng)物房采用12h白天/黑夜循環(huán)周期的光照。所有實(shí)驗(yàn)程序均遵循神經(jīng)科學(xué)研究關(guān)于哺乳動(dòng)物的照料與使用規(guī)定。

1.2 主要試劑 丹參多酚酸鹽B（120418）購(gòu)于上海綠谷制藥有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）（ab196495）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（ab232479）、β-actin（ab179467）抗體均購(gòu)于英國(guó)abcam公司。

1.3 分組和丹參多酚酸鹽B藥物注射 38只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只作為對(duì)照組，常規(guī)飼養(yǎng)；剩下28只制作糖尿病大鼠模型。大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）60mg/kg（9g STZ 溶于 1L 0.9%檸檬酸鹽緩沖劑，6.7ml/kg），注射后72h采集尾靜脈血液，采用血糖儀檢測(cè)血糖水平，血糖＞16.7mmol/L視為糖尿病模型制作成功。共有20只大鼠造模成功，再采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和治療組，每組10只。對(duì)照組大鼠給予檸檬酸鹽緩沖劑（6.7ml/kg）。模型制作成功后1周，治療組大鼠給予丹參多酚酸鹽B 20mg/kg（3g丹參多酚酸鹽B溶于1L 0.9%氯化鈉溶液，6.7ml/kg）腹腔注射治療，1次/d，連續(xù)6周。對(duì)照組和糖尿病組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液（6.7ml/kg）腹腔注射治療，1次/d，連續(xù)6周。

1.4 血糖測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及治療結(jié)束時(shí)，取大鼠尾靜脈血液，利用血糖儀測(cè)量各組大鼠血糖水平。

1.5 Morris水迷宮測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力 丹參多酚酸鹽B治療結(jié)束后第2天進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)。水迷宮水池桶直徑1.5m、高0.5m，池內(nèi)水深40cm，水溫控制在21～24℃。隱性平臺(tái)（直徑10cm）位于水面下1cm處，放置在目標(biāo)象限中央。前5d進(jìn)行定位航行試驗(yàn)，每只大鼠面朝池壁放入水池中，記錄逃避潛伏期，即大鼠登上水下平臺(tái)的時(shí)間；第6天去除水下平臺(tái)，進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠跨臺(tái)次數(shù)。

1.6 凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。每組隨機(jī)選取5只大鼠，5%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，冰上分離海馬組織。研磨海馬組織后加入RIPA裂解液，離心后取上清液，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜。TTBS 處理后與 Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗相結(jié)合，4°C 過(guò)夜。洗膜后與二抗相結(jié)合并孵育。利用凝膠成像系統(tǒng)顯影成像。采用Image Lab配套軟件分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白光密度值（IOD）/內(nèi)參IOD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠治療前后血糖水平比較 3組大鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前血糖水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，與對(duì)照組比較，糖尿病組和治療組大鼠血糖水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與糖尿病組比較，治療組大鼠血糖水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 3組大鼠治療前后血糖水平比較（mmol/L）

2.2 3組大鼠逃避潛伏期和跨臺(tái)次數(shù)比較 與對(duì)照組比較，糖尿病組和治療組大鼠逃避潛伏期均延長(zhǎng)，跨臺(tái)次數(shù)均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與糖尿病組比較，治療組大鼠逃避潛伏期縮短，跨臺(tái)次數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠逃避潛伏期和跨臺(tái)次數(shù)比較

2.3 3組大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，糖尿病組和治療組大鼠Bax表達(dá)水平均升高，Bcl-2表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與糖尿病組比較，治療組大鼠Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表 3。

3 討論

糖尿病是世界上最常見(jiàn)的代謝紊亂性疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。2015年全世界大約有4.15億人患有糖尿病，到2040年，這個(gè)數(shù)字將達(dá)到6.42億[7]。糖尿病被公認(rèn)為是影響認(rèn)知功能障礙發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。本研究證明STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶的損傷，但經(jīng)丹參多酚酸鹽B治療后，糖尿病大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。

表3 3組大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)水平比較

丹參多酚酸鹽B是一種重要的生物活性化合物，它是從中國(guó)傳統(tǒng)藥用植物丹參中提取的，具有抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)作用[9-10]。研究表明丹參多酚酸鹽B能夠維持神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的自我更新和增殖，從而保護(hù)神經(jīng)元不受細(xì)胞凋亡的影響并減輕由短暫性腦缺血引起的學(xué)習(xí)和記憶障礙[11]。先前研究已表明，丹參多酚酸鹽B具有很強(qiáng)的抗氧化活性[12]，如防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制丙二醛形成，以及降低血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子介導(dǎo)的細(xì)胞膜滲透性[13]。然而丹參多酚酸鹽B對(duì)于糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制的研究較少報(bào)道。

糖尿病導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的機(jī)制仍不是十分明確。據(jù)報(bào)道，大鼠的慢性高血糖會(huì)導(dǎo)致大腦皮層神經(jīng)元的顯著喪失，這可能會(huì)損害認(rèn)知能力。動(dòng)物研究表明，由STZ引起的慢性高血糖降低了大鼠腦中乙酰膽堿的合成和釋放，對(duì)于認(rèn)知功能同樣造成影響[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽B治療后糖尿病大鼠的血糖水平明顯降低，這可能是其改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能的作用機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和包括阿爾茨海默病在內(nèi)的許多慢性神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，凋亡的發(fā)生同樣是糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能障礙的重要生物學(xué)機(jī)制[15]。線粒體內(nèi)在凋亡過(guò)程發(fā)生在線粒體中，主要涉及到Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族主要包括抗凋亡蛋白（如Bax）和促凋亡蛋白（如Bcl-2）。學(xué)習(xí)和記憶能力與許多大腦結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，如海馬區(qū)，因此本研究檢測(cè)了海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠海馬組織Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，應(yīng)用丹參多酚酸鹽B治療后海馬組織Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，提示丹參多酚酸鹽B明顯抑制了糖尿病大鼠海馬組織凋亡的發(fā)生，這可能是其改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能的重要機(jī)制。

綜上所述，丹參多酚酸鹽B治療可明顯改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能，其作用機(jī)制可能與提高Bax的表達(dá)并降低Bcl-2的表達(dá)，從而抑制凋亡通路密切相關(guān)。