吳凱 封志云 胡小堅(jiān)

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重的損傷，常導(dǎo)致?lián)p傷平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)功能障礙，致殘率高，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。目前，對(duì)于SCI仍無有效的治療方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中提取的多酚的活性成分，能清除氧自由基，易透過血腦屏障，是重要的天然抗氧化劑。研究表明，EGCG具有抗腫瘤、抗細(xì)胞凋亡、抗炎等多種生物學(xué)效應(yīng)[1-3]。同時(shí)，大量研究證實(shí)EGCG對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[4-5]，但其機(jī)制仍不明確。本研究采用擠壓型方法制作小鼠急性SCI動(dòng)物模型，術(shù)后通過小鼠BMS評(píng)分評(píng)價(jià)EGCG對(duì)SCI后小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)作用，并觀察脊髓組織細(xì)胞形態(tài)變化，檢測(cè)Cleaved Caspase-3、B細(xì)胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）蛋白表達(dá)水平，以探討其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雌性健康SPF級(jí)C57BL/6小鼠35只，體重18～24g，購(gòu)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)，每籠5只。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)，室溫控制在20～25℃，給予動(dòng)物12h光照/12h黑暗交替的環(huán)境。所有動(dòng)物自由攝食攝水。操作均嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要器材和試劑 血管夾（15g）購(gòu)自上海醫(yī)療器械有限公司，EGCG（E4143，50mg）購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司，Cleaved Caspase-3抗體（9661）和 Bax抗體（14796）購(gòu)自美國(guó)Cell Signalling Technology公司、Bcl-2抗體（ab182858）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 小鼠急性SCI動(dòng)物模型建立及分組 采用擠壓型方法制作小鼠急性SCI動(dòng)物模型，具體操作如下：用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠，俯臥位固定，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。在T8～10水平作背部正中切口，充分暴露并切除T8～10棘突及椎板，充分暴露脊髓T9節(jié)段，用15g力度的血管夾夾住T9段脊髓1min，夾閉1min后放開血管夾。止血后逐層縫合切口。制作SCI小鼠25只，為保證模型統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，造模后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，選取行為學(xué)評(píng)分≤1分的小鼠20只（剔除行為學(xué)評(píng)分＞1分的小鼠5只）。采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的20只小鼠分為EGCG組和SCI組，每組10只。另10只未造模的小鼠僅行椎板切除，作為假手術(shù)組。EGCG組小鼠于造模后給予EGCG（50mg/kg，50mg溶于10ml 0.9%氯化鈉注射液，10ml/kg）腹腔注射，1次/d，連續(xù) 7d。假手術(shù)組和SCI組小鼠給予0.9%氯化鈉注射液（10ml/kg）腹腔注射，1 次/d，連續(xù) 7d。

1.4 行為學(xué)評(píng)分 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，將小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能分為10個(gè)等級(jí)，完全正常行走為9分，后肢完全癱瘓為0分。分別于術(shù)后第1、3、5、7天進(jìn)行小鼠BMS評(píng)分，將動(dòng)物置于寬闊活動(dòng)場(chǎng)地自由活動(dòng)5min，觀察其后肢運(yùn)動(dòng)情況，左右兩側(cè)肢體分別評(píng)分，取平均值為每只大鼠的功能得分。由不參與動(dòng)物分組與治療但熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的2位觀察者同時(shí)獨(dú)立進(jìn)行評(píng)分，取平均值。

1.5 脊髓組織細(xì)胞形態(tài)變化觀察 術(shù)后第7天，每組取6只小鼠進(jìn)行病理學(xué)觀察，腹腔注射過量戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，經(jīng)左心室灌注0.9%氯化鈉注射液至流出澄清液，再用4%多聚甲醛心臟灌注固定后，以損傷中心區(qū)為中點(diǎn)取1cm左右脊髓組織樣本，PBS清洗后置于4%多聚甲醛中固定，再行脫水、包埋、切片等步驟，行HE染色，鏡下觀察各組脊髓瘢痕和空洞面積，評(píng)價(jià)脊髓損傷程度。

1.6 脊髓組織Cleaved Caspase-3表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組化法。上述小鼠每只取5張距損傷中心或相應(yīng)部位0.5cm內(nèi)的切片，常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫處理、高溫修復(fù)、血清封閉、一抗 4℃過夜（濃度為 1∶150），同時(shí)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，隔日滴加二抗，室溫孵育30min，繼而二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，甘油封片后，倒置顯微鏡下觀察切片陽(yáng)性表達(dá)（棕色）的部位及強(qiáng)弱程度，用Image-Pro Plus 6.0軟性行平均光密度分析。以上各步驟間均用PBS充分漂洗3次，5min/次。

1.7 脊髓組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。術(shù)后第7天，每組取4只小鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死，直視下取出包含損傷部位在內(nèi)的1cm脊髓組織，獲取脊髓蛋白，根據(jù)蛋白濃度進(jìn)行等量上樣，電泳，轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉，4℃一抗 Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2 孵育過夜，洗膜，室溫下熒光二抗孵育1h，充分洗膜，ECL試劑發(fā)光，暗室曝光顯影。凝膠成像分析系統(tǒng)上攝像分析，并定量分析條帶灰度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠BMS評(píng)分比較 SCI后，小鼠雙后肢均全癱。與假手術(shù)組比較，術(shù)后各時(shí)點(diǎn)SCI組和EGCG組小鼠BMS評(píng)分均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與 SCI組比較，術(shù)后第 3、5、7 天 EGCG 組小鼠BMS評(píng)分均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠BMS評(píng)分比較（分）

2.2 小鼠脊髓組織病理檢查結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞分布均勻；SCI組小鼠脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞核仁模糊，細(xì)胞腫脹，周圍間隙增大，出現(xiàn)大量壞死細(xì)胞，形成大量空泡，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度高；EGCG組小鼠壞死神經(jīng)細(xì)胞較SCI組有所減少，空泡數(shù)量減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度低，見圖1。

圖1 小鼠脊髓組織病理切片所見（a：假手術(shù)組；b：SCI組；C：EGCG組；HE染色，×20）

2.3 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3表達(dá)水平比較 術(shù)后第7天，與假手術(shù)組比較，SCI組和EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與SCI組比較，EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3的表達(dá)有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2-3。

圖2 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3免疫組化染色結(jié)果（a：假手術(shù)組小鼠Cleaved Caspase-3無明顯陽(yáng)性表達(dá)；b：SCI組小鼠可見大部分細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性；C：EGCG組小鼠可見部分細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性；免疫組化染色，×40）

圖3 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3表達(dá)的平均光密度值比較（與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與 SCI組比較，△P＜0.05）

2.4 3組小鼠脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 術(shù)后第7天，與假手術(shù)組比較，SCI組和EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表達(dá)水平均升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與SCI組比較，EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表達(dá)水平均降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（a：3組小鼠脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖；b：3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較；c：3組小鼠脊髓組織Bax蛋白表達(dá)水平比較；d：3組小鼠脊髓組織Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與 SCI組比較，△P＜0.05）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EGCG治療后，SCI小鼠的BMS評(píng)分明顯升高，提示EGCG可明顯改善SCI小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。SCI可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷發(fā)生在損傷當(dāng)時(shí)，其結(jié)果是不可逆的，而繼發(fā)性損傷則是損傷后發(fā)生的一系列復(fù)雜的分子生物學(xué)反應(yīng)引起的神經(jīng)元可逆性損傷，因此，有效抑制繼發(fā)性損傷是治療SCI的重點(diǎn)。脊髓繼發(fā)性損傷的過程十分復(fù)雜，其機(jī)制包括缺血缺氧[7]、脂質(zhì)過氧化[8]、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載[9]、興奮性氨基酸毒性[10]、神經(jīng)細(xì)胞凋亡[11]等。其中，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性損傷的重要病理基礎(chǔ)，因此，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡可有效減少繼發(fā)性損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

細(xì)胞凋亡是受一系列連續(xù)基因調(diào)控的程序化反應(yīng)，通常可以分為死亡受體（外源性）和線粒體（內(nèi)源性）兩條途徑。在凋亡過程中，Bcl-2家族蛋白起重要調(diào)控作用，主要參與細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡途徑完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。Bcl-2家族可以分為兩類：一類是抗凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因；另一類是促凋亡基因，代表基因是Bax基因。而Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-3被活化成Cleaved Caspase-3，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[12-14]。EGCG是從綠茶中提取的多酚的活性成分，研究表明，EGCG具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可抑制各種誘因?qū)е碌募?xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。Shi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過激活NRF2/HO-1通路來抑制微囊藻毒素誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；Yan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過抑制氧化應(yīng)激來抑制H2O2誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的凋亡；Du等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來減少阿爾茲海默病中的神經(jīng)毒性。本實(shí)驗(yàn)觀察到，SCI小鼠Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，EGCG治療后，小鼠Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，提示EGCG對(duì)SCI小鼠有明顯的抗凋亡作用。

綜上所述，EGCG治療可明顯促進(jìn)SCI小鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，其對(duì)小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制可能與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)了EGCG治療對(duì)SCI小鼠的保護(hù)作用，這為SCI的基礎(chǔ)和臨床治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。然而，這一作用具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步的研究去揭示。