李超 李誠(chéng) 李春艷

摘要：擬建立小麥籽粒中脫落酸、生長(zhǎng)素的快速提取方法和高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)2種激素的試驗(yàn)體系。經(jīng)試驗(yàn)對(duì)比，采用異丙醇、水、濃鹽酸體積比=2 ∶ 1 ∶ 0.002的混合溶液作為提取液，以二氯甲烷作為萃取溶劑，簡(jiǎn)化了提取過(guò)程，提高了提取效率。HPLC的分離采用ZORBAXSB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）反相色譜柱，柱溫為 26 ℃，檢測(cè)器波長(zhǎng)為262 nm，流動(dòng)相為甲醇、乙酸水溶液（乙酸的體積分?jǐn)?shù)為0.2%），其中甲醇、乙酸體積比=38 ∶ 62，流速為1 mL/min。結(jié)果表明，小麥籽粒中2種激素的分離效果較好，加標(biāo)回收率達(dá)95.8%～96.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.14%～1.59%之間。由此可見(jiàn)，該提取方法和檢測(cè)體系的建立為快速提取和檢測(cè)小麥籽粒中的脫落酸和生長(zhǎng)素提供了可靠的方法。

關(guān)鍵詞：小麥;脫落酸;生長(zhǎng)素;高效液相色譜

中圖分類號(hào)： S512.101 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0194-03

植物激素在植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用[1-3]。小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，內(nèi)源性激素對(duì)小麥灌漿期籽粒的發(fā)育影響很大，會(huì)直接影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]。因此，研究小麥內(nèi)源激素的變化，對(duì)于通過(guò)人工干預(yù)措施調(diào)控小麥生產(chǎn)具有重要的實(shí)踐價(jià)值?，F(xiàn)有的檢測(cè)植物內(nèi)源性激素的方法有生物鑒定法[6]、生物傳感器法、酶聯(lián)免疫法、光譜和色譜法，其中色譜法包括氣相色譜法（GC）或與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法、高效液相色譜法（HPLC）或與質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法、超高效液相色譜法等。生物鑒定法、光譜法和生物傳感器法因其專一性和局限性限制在近年來(lái)鮮有報(bào)道。間接酶聯(lián)免疫法因其使用方便、成本低、速度快而使其使用較為普遍，但靈敏度低，不能較好地滿足實(shí)際檢測(cè)需要[7]。氣相色譜法因大部分植物激素含有極性基團(tuán)，不易揮發(fā)，需要進(jìn)行衍生化處理才能測(cè)定[8]。高效液相色譜法不需要對(duì)激素進(jìn)行衍生化處理，可直接進(jìn)行測(cè)定，且準(zhǔn)確性、靈敏度和重現(xiàn)性都比較好，是目前最常見(jiàn)的測(cè)定植物內(nèi)源性激素的方法?，F(xiàn)階段分析儀器已達(dá)到了較高的水平，相對(duì)于激素的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，樣品的前處理是整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中的關(guān)鍵，冗長(zhǎng)而復(fù)雜的前處理常常會(huì)造成樣品提取率低、雜質(zhì)干擾太大，從而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。近年來(lái)，有較多學(xué)者對(duì)植物內(nèi)源性激素的提取做了研究，目前主要的提取方法是用80%甲醇過(guò)夜浸提[9]，但是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（需要12 h以上），后續(xù)純化步驟過(guò)于繁瑣且需要大量的溶劑，成本較高。因此，改良前處理方法對(duì)植物內(nèi)源性激素的測(cè)定顯得尤為重要。本研究擬對(duì)比2種提取脫落酸和生長(zhǎng)素的方法，優(yōu)化樣品前處理過(guò)程，以期為小麥籽粒內(nèi)源性激素的提取、測(cè)定提供一種簡(jiǎn)便、高效、可行的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選擇新疆主栽冬小麥品種新冬22號(hào)為試驗(yàn)材料，種子由石河子大學(xué)冬小麥課題組提供。試驗(yàn)于2016—2017年在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站（44°17N，86°03E，海拔461 m）進(jìn)行。抽穗當(dāng)天掛牌標(biāo)記，開(kāi)花當(dāng)天選取同天開(kāi)花、長(zhǎng)勢(shì)一致的麥穗掛牌標(biāo)記。分別于小麥開(kāi)花后10、20、30 d取穗中上部籽粒，立即置于液氮中速凍5 min，再置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試驗(yàn)儀器：高效液相色譜儀（Agilent Technologies，Agilent 1260，USA）;冷凍離心機(jī)（Eppendorf，Centrifuge 5424，Germany）;氮吹儀（Organomation，N-EVAP-45，USA）;臺(tái)式恒溫?fù)u床（NEW BRUNSWICK，Innova 40 R，UK）;紫外分光光度計(jì)（HITACHI，U-5100，Japan）;電子天平（Sartorius，BS 210 s，Germany）。

生長(zhǎng)素（IAA）、脫落酸（ABA）標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)于Sigma公司;甲醇（流動(dòng)相）為色譜純，購(gòu)于Fisher公司（美國(guó)）;色譜純冰乙酸，購(gòu)于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;甲醇（提取液）、石油醚、乙酸乙酯為國(guó)產(chǎn)分析純;超純水為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 激素提取方法的建立

方法1：激素的提取參考Wu等的方法[10]并作適當(dāng)修改后進(jìn)行：準(zhǔn)確稱取4 g用液氮研磨的小麥籽粒粉末，加入 16 mL 提取緩沖液（樣品與提取緩沖液體積比保持1 ∶ 4，以體積比為2 ∶ 1 ∶ 0.002的異丙醇、水、濃鹽酸溶液為提取緩沖液，以0.001 mol/L丁基化羥基甲苯作為抗氧化劑），于4 ℃、200 r/min振蕩30 min。再加入32 mL（提取緩沖液體積的2倍）二氯甲烷，于4 ℃、200 r/min振蕩30 min。之后于4 ℃、 12 000 r/min 離心10 min，取下清液，在避光條件下用氮?dú)獯蹈桑蛹状级ㄈ葜? mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，上HPLC分析。

方法2：準(zhǔn)確稱取4 g用液氮研磨后的小麥籽粒粉末，加入10 mL預(yù)冷的80%甲醇溶液，振蕩搖勻后置于4 ℃冰箱過(guò)夜;浸提過(guò)夜后于4 ℃、8 000 r/min離心10 min得上清液，將殘?jiān)尤?0 mL 80%甲醇中浸提3 h，該步驟重復(fù)2次后合并上清液。將合并后的上清液用氮吹儀濃縮至原體積的1/3，加入30 mL石油醚萃取脫色3次，棄上清。再用20 mL乙酸乙酯對(duì)水相溶液萃取3次，合并酯相后用氮吹儀吹干。用pH值為3.5的乙酸水溶液溶解，溶液過(guò)預(yù)處理后的Sep-Pak C18小柱純化，用甲醇洗脫（之后發(fā)現(xiàn)二氯甲烷的洗脫效率更高，遂改為二氯甲烷洗脫）。將洗脫液在避光條件下用氮?dú)獯蹈?，用甲醇定容? mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，上機(jī)分析[9]。

1.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAXSB-C18（150 mm×4.6 nm，5 μm，Agilent公司），流動(dòng)相A為甲醇，B為乙酸水溶液。流速為 1 mL/min，柱溫為26 ℃，檢測(cè)器波長(zhǎng)為262 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇（色譜純）將生長(zhǎng)素、脫落酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為 1 mg/mL 的母液，根據(jù)出峰情況逐級(jí)稀釋作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

取小麥籽粒（花后20 d）并用液氮研磨，將研磨后的小麥粉分為4份，每份4 g;取2份小麥籽粒樣品，其中1份加入 5 000 ng 標(biāo)準(zhǔn)樣品，同時(shí)用第1.2節(jié)中的方法1進(jìn)行激素的提取;對(duì)于剩余的2份樣品按照第1.2節(jié)中的方法2進(jìn)行樣品的加標(biāo)回收率測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

用紫外分光光度計(jì)對(duì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行掃描，同時(shí)兼顧2種激素的分離效果。分析發(fā)現(xiàn)，溶液在262 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，且2種激素在262 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下均有較好的峰形，故選擇在262 nm波長(zhǎng)下對(duì)樣品的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定。

2.2 流動(dòng)相配比

參考前人以甲醇、水作為流動(dòng)相進(jìn)行的激素分離研究，分別以體積分?jǐn)?shù)為60%、50%、40%、30%、20%的甲醇作為流動(dòng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇含量為40%、30%時(shí)，2種激素能夠與雜質(zhì)分離。隨即進(jìn)行微調(diào)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇含量為38%時(shí)，2種激素的分離效果顯著。

2.3 流動(dòng)相pH值

由于目標(biāo)激素均為弱酸性樣品，因此通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值可以抑制樣品的解離，以增加樣品組分在固定相上的保留時(shí)間，改善峰形。分別在水相（總體積為1 L）中加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0 mL冰乙酸，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入2 mL冰乙酸時(shí)，2種激素峰形尖銳且各組分的分離效果較好。因此，采用體積分?jǐn)?shù)為0.2%的乙酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.4 流速和柱溫

分別檢測(cè)不同流速（0.4、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0 mL/min）下2種激素的分離效果，發(fā)現(xiàn)流速過(guò)大時(shí)，各激素峰分離差，容易出現(xiàn)肩峰;流速過(guò)小時(shí)，整個(gè)分離過(guò)程的時(shí)間大大增加。綜合考慮，選用1.0 mL/min的流速。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，柱溫對(duì)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的影響較小，故選擇室溫為26 ℃。

選擇最優(yōu)色譜條件，對(duì)2種激素的混合標(biāo)樣進(jìn)行檢測(cè)。從圖1可以看出，2種激素的分離和檢測(cè)結(jié)果良好。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其線性范圍

在“1.3”節(jié)的色譜條件下，以峰值面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各激素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍。表1結(jié)果顯示，激素標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的線性相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定和樣品加標(biāo)回收率

如表2所示，在樣品加標(biāo)回收率測(cè)定中，使用方法1提取得到的樣品含量極顯著高于方法2得到的樣品含量，方法1的樣品加標(biāo)回收率也顯著高于方法2的樣品加標(biāo)回收率。激素的提取通常使用的是相似相溶原理，現(xiàn)階段常用的激素提取方法是用80%甲醇于4 ℃過(guò)夜浸提[11-13]，如簡(jiǎn)利茹等用乙腈和水按一定比例混合后提取菌液中的植物激素[14]，劉同祥等用純乙腈提取辣椒幼苗中的植物激素[15]，馬宏棋等用一定比例的甲醇、乙酸乙酯和甲酸提取草莓中的脫落酸[16]。這些方法雖然能夠從植物組織中有效地提取出植物激素，但是后續(xù)步驟過(guò)于繁瑣，需要大量的時(shí)間和溶劑，且成本較高。本研究通過(guò)不斷試驗(yàn)，以異丙醇、水、濃鹽酸溶液（異丙醇、水、濃鹽酸體積比為 2 ∶ 1 ∶ 0.002）作為提取液并加入丁基化羥基甲苯作為抗氧化劑防止激素氧化分解，經(jīng)過(guò)短時(shí)間的振蕩后用二氯甲烷萃取就可以得到目標(biāo)激素，大大節(jié)省了時(shí)間和成本。通過(guò)2種提取方法的對(duì)比，本研究采用的方法在提取率上優(yōu)于將80%甲醇作為脫落酸和生長(zhǎng)素的提取方法，此方法簡(jiǎn)化了后續(xù)處理步驟，大大減少了目標(biāo)激素的損失。

2.7 小麥籽粒不同發(fā)育時(shí)期的激素含量

如圖2所示，小麥籽粒中的2種激素得到良好的分離，與方法2相比， 用方法1提取的樣品雜質(zhì)峰相對(duì)較少。采用方法1建立的快速提取方法及第1.3節(jié)的色譜條件測(cè)定小麥花后10、20、30 d籽粒中的激素含量。檢測(cè)結(jié)果顯示，花后10、20、30 d籽粒中IAA的鮮質(zhì)量含量分別為1 382、412、267 ng/g，ABA的鮮質(zhì)量含量分別為283、922、475 ng/g。IAA是高等植物體內(nèi)主要的細(xì)胞分裂素之一，花后10 d左右是小麥胚乳細(xì)胞增殖時(shí)期，這個(gè)時(shí)期較高含量的IAA有助于胚乳細(xì)胞快速增殖，以增加籽粒的庫(kù)容量[17];花后20 d是小麥籽粒灌漿的高峰時(shí)期，這個(gè)時(shí)期ABA含量比較高，這是由于籽粒中的ABA能夠控制籽粒的成熟，提高籽粒灌漿速率[4，18]。

3 結(jié)論

通過(guò)2種激素提取方法的比較，本研究建立了1種簡(jiǎn)單、快速、高效提取小麥籽粒中脫落酸、生長(zhǎng)素的方法和HPLC檢測(cè)條件。本研究建立的提取方法，能夠滿足對(duì)小麥籽粒中脫落酸和生長(zhǎng)素定量分析的要求，為進(jìn)一步研究脫落酸和生長(zhǎng)素對(duì)小麥籽粒發(fā)育的影響提供了基礎(chǔ)，也為其他植物樣品激素的提取提供了參考。

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