付玉和, 孫文麗, 黃震巨, 程 奇

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081;2.杭州眾測生物科技有限公司, 杭州 310052

重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增技術(shù)(recombinase-aid amplification,RAA)，是一種利用體內(nèi)擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)在體外進(jìn)行核酸快速擴(kuò)增的新型擴(kuò)增技術(shù)，即利用從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶，在常溫下形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，打開模板 DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級增長[1,2]。RAA技術(shù)能在常溫下以較短的時(shí)間實(shí)現(xiàn)核酸快速擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳或?qū)崟r(shí)熒光檢測實(shí)現(xiàn)目的基因的快速檢測。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異形成的一種分子遺傳標(biāo)記[3]，在分子遺傳學(xué)和各種遺傳疾病的診斷和治療中扮演著重要角色。目前普遍應(yīng)用于SNP檢測的技術(shù),如變性梯度凝膠電泳、直接測序、DNA芯片技術(shù)等,存在著技術(shù)復(fù)雜、應(yīng)用成本高等缺點(diǎn)[4]。因此研究開發(fā)潛在的具有大規(guī)模商業(yè)化用途的檢測方法一直是研究的熱點(diǎn)。通過擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測作為一種應(yīng)用技術(shù)在過去幾十年間迅猛發(fā)展，一直是檢測的主流方法。利用3′→5′外切酶活性的具有校正功能的高保真酶實(shí)現(xiàn)SNP檢測的研究也一直在進(jìn)行中[5]。那么更進(jìn)一步突變高保真聚合酶的3′→5′外切酶活性利用高保真聚合酶在擴(kuò)增過程中的聚合反應(yīng)非成熟性終止能力是否具有潛在的SNP檢測能力尚未見研究報(bào)道。

Klenow(exo-)是一種來源于大腸桿菌的聚合酶，該酶采用突變方式去除了校正核酸酶活性(3′→5′)和(5′→3′)缺口平移酶活性[6]，具有鏈置換活性和較高的特異性，具有應(yīng)用于SNP檢測的潛能[7]。因此本文在前人研究的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種新的Klenow(exo-)蛋白制備方案并結(jié)合恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的RAA技術(shù)對其在SNP檢測中的潛在應(yīng)用進(jìn)行了嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌菌株：BL21、DH5α、E.coliRosetta (DE3)本實(shí)驗(yàn)室保存。LB 培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L胰蛋白胨，pH 7.0。

1.2 試劑

KOD高保真聚合酶購自TOYOBO公司；TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自上海生工生物公司；無縫克隆試劑盒購自北京全式金有限公司；層析分離介質(zhì)Ni Sepharose 6 Fast Flow預(yù)裝柱，Heprine預(yù)裝柱購自GE公司；組織裂解液購自百代生物有限公司。

緩沖液配方：B: 30 mmol/L磷酸鹽(pH 7.4)，40 mmol/L咪唑，500 mmol/L氯化鈉；C: 30 mmol/L磷酸鹽(pH 7.4)，100 mmol/L咪唑，500 mmol/L氯化鈉；D：30 mmol/L磷酸鹽(pH 7.4)，300 mmol/L咪唑，500 mmol/L氯化鈉；E:20 mmol/L Tris,50 mmol/L氯化鉀，1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA；F：20 mmol/L Tris, 2 mol/L氯化鉀1 mmol/L DTT,1 mmol/L EDT。

1.3 目的片段的擴(kuò)增

大腸桿菌基因組為模板分別用引物F1、R1和F2、R2(引物序列見表1，由擎科(杭州)生物公司合成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后目的片段進(jìn)行膠回收。然后以回收的兩條目的片段等比例混合為模板，以F1和R2為上、下游引物進(jìn)行Overlap PCR獲得所需的目的片段。反應(yīng)體系均為25 μL，反應(yīng)后產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳后結(jié)果以膠回收試劑盒回收目的片段PCR產(chǎn)物。大片段擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 2 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。小片段擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 40 s，57℃ 40 s，72℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。Overlap PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 2 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。

表1 本研究所用引物列表Table 1 Primer sequence used in the study.

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

以質(zhì)粒提取試劑盒提取pTrc99a質(zhì)粒載體，然后以NcoⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒載體和膠回收目的片段。酶切體系如下：質(zhì)粒1 μg，限制性內(nèi)切酶各1 μL，10×Buffer 2 μL， 補(bǔ)加去離子水至總體積20 μL。酶切后產(chǎn)物以純化試劑盒純化。將Klenow(exo-)目的基因片段和線性化后的質(zhì)粒載體以2∶1的比例配制10 μL連接體系。連接反應(yīng)條件為25℃連接3 h，質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖1所示。

圖1 pTrc99a-Klenow(exo-)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction diagram of pTrc99a-Klenow(exo-) plasmid.

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株：連接反應(yīng)結(jié)束后將連接產(chǎn)物加入100 μL感受態(tài)中，冰浴30 min后42℃熱激90 s，冰浴2 min，加入500 μL LB培養(yǎng)基。37℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)1 h取200 μL菌液涂布于含氨芐抗性的LB平板上,37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

挑取單克隆至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.6左右。取1 μL菌液為模板以F1、R2為引物進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆可見1 900 bp的條帶。并將陽性菌落送至杭州擎科生物科技有限公司測序，將測序正確無突變的陽性克隆菌株凍存并提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta (DE3)表達(dá)菌株。

挑取轉(zhuǎn)化后單菌落接種至5 mL，LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度為 0.5 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)4 h ，收集少量菌體，超聲破碎菌體后離心分離上清液與沉淀，將破碎后的上清和沉淀加入適量Loading Buffer，沸水浴3～5 min后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。

1.5 陽性克隆菌的搖瓶發(fā)酵及Klenow(exo-)蛋白的純化

挑單克隆菌至100 mL LB培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)作為一級種子，然后將一級種子以2%的比例接種至6瓶600 mL的液體LB培養(yǎng)基中。37℃ 200 r/min 培養(yǎng)至OD600為 0.6時(shí)加入終濃度為 0.5 mmol/L IPTG，于37℃誘導(dǎo)4 h。

在4℃ 6 000 r/min條件下離心30 min,棄上清收集菌體。用破碎緩沖液[緩沖液A:30 mmol/L MPB(pH 7.4)，20 mmol/L咪唑，500 mmol/L氯化鈉]重懸菌體。將重懸后的菌液以ATS高壓均質(zhì)機(jī)(800 Mpa，4℃)破碎3次。打開離心機(jī)預(yù)冷后以4℃ 16 000 r/min 離心破碎液，上清用鎳柱做親和層析。分別用緩沖液B、C、D洗脫后將目的蛋白透析至緩沖液E中。

透析后以緩沖液E為平衡液，以緩沖液F為洗脫液線性洗脫。洗脫后目的蛋白再次透析至E緩沖液中。凍存至-80℃冰箱中待用。

1.6 Klenow(exo-)蛋白結(jié)合RAA體系對SNP檢測的應(yīng)用

以Klenow(exo-)蛋白結(jié)合其他所需蛋白配制RAA反應(yīng)體系，設(shè)計(jì)引物SalF、SalR、SalF(突)(表1)，質(zhì)粒模板采用含沙門氏菌invA基因的質(zhì)粒(南京金斯瑞合成)。按照RAA 50 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系[2],最后加入100 mmol/L醋酸鎂激活反應(yīng)。反應(yīng)條件為：37℃，30 min，加入50 μL 酚-氯仿1∶1溶液結(jié)束反應(yīng),并以12 000 r/min離心5 min,離心后最上層上清為擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增后產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 基于Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系

分別稱取30 mg的水牛肉和牦牛肉加入組織裂解液。12 000 r/min離心10 min取上清用水稀釋至10-1、10-2，分別檢測核酸濃度約為10 ng/μL、1 ng/μL，以此為模板，以線粒體Cytb基因?yàn)榘谢?，根?jù)水牛和牦牛序列的差異設(shè)計(jì)引物序列F、R(F引物與水牛靶序列匹配，與牦牛靶序列在3′端有兩個(gè)連續(xù)突變，R序列與水牛，牦牛靶序列均完全匹配，表1)。分別用Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系和PCR體系(TaqDNA聚合酶)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

通過PCR方式引入突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物時(shí)使兩個(gè)片段帶有20 bp左右的同源重組區(qū)[7]，PCR擴(kuò)增獲得大小分別約為1 800 bp、120 bp的目的蛋白條帶。通過Overlap PCR獲得大小約1 900 bp目的片段(圖2)，通過載體與目的片段雙酶切連接轉(zhuǎn)化后獲得含有目的片段的載體。陽性克隆片段提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后明顯可見約1 900 bp目的蛋白條帶及4 000 bp線性化質(zhì)粒條帶(圖3)，驗(yàn)證后質(zhì)粒進(jìn)一步送測序驗(yàn)證。測序后結(jié)果與預(yù)期的目的蛋白基因序列完全相符，說明獲得了正確的目的基因。

圖2 Overlap PCR獲得目的片段Fig.2 The desired segment obtained by Overlap PCR.注: 1～2: Overlap PCR結(jié)果， M:2 000 bp Marker

2.2 融合蛋白表達(dá)情況的分析及蛋白制備

SDS-PAGE結(jié)果表明工程菌在37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后，超聲破碎取上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，在約65 kDa處有明顯的目的蛋白條帶與預(yù)期的Klenow(exo-)蛋白大小一致(圖4)。鎳柱親和層析后SDS-PAGE結(jié)果顯示，在65 kDa處40 mmol/L、100 mmol/L咪唑洗脫液中均有明顯的目的蛋白，其中100 mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白純度較高?？捎糜谀康牡鞍椎倪M(jìn)一步純化。通過GE公司預(yù)裝柱Heparine HP 除去部分目的蛋白中殘留的核酸并對目的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的精細(xì)純化。由結(jié)果可見經(jīng)過肝素柱純化后目的蛋白純度有了明顯的提高，有利于后續(xù)的檢測反應(yīng)，純化后目的蛋白如圖5所示。

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid1:重組質(zhì)粒雙酶切后; 2:重組質(zhì)粒雙酶切前; M:2 000bp核酸Marker

圖4 工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)檢測Fig.4 Expression detection of engineered strain induced.1:未誘導(dǎo)對照沉淀;2:未誘導(dǎo)對照上清;3:誘導(dǎo)1號菌沉淀;4:誘導(dǎo)2號菌上清;5:誘導(dǎo)2號菌沉淀;6:誘導(dǎo)1號菌上清;M:蛋白Marker.

2.3 檢測體系的配制及質(zhì)粒檢測結(jié)果

用Klenow(exo-)配制 RAA體系后擴(kuò)增結(jié)果顯示，在模板濃度為100 pg/μL以上時(shí)引物3′端發(fā)生突變后不能有效擴(kuò)增目的片段，引物正常匹配時(shí)擴(kuò)增效果良好，有明顯的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。顯示了Klenow(exo-)酶對突變堿基較強(qiáng)的特異性。當(dāng)模板濃度低于100 pg/μL突變和非突變引物均不能有效擴(kuò)增目的片段(圖6和圖7)。由結(jié)果可知該體系在對于濃度高于100 pg/μL的核酸樣本時(shí)能明顯區(qū)分是否發(fā)生突變，在模板濃度較低的情況下效果不明顯，這可能是由反應(yīng)體系本身的限制引起，尚需對反應(yīng)體系本身做進(jìn)一步優(yōu)化處理。

圖5 目的蛋白肝素柱純化Fig.5 Purification by Heparine.注：1～4：Heparine柱線性洗脫目的蛋白。

圖6 引物正常匹配擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Amplification of primer normally matched.注:模板濃度為:1,2: 10 ng/μL; 3,4: 1 ng/μL; 5,6: 100 pg/μL; 7,8: 10 pg/μL; M:2 000 bp Marker。

圖7 引物3′ 端雙堿基突變后的擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 Amplification of primer 3′-terminal mutation.注:模板濃度為:1,2: 10 ng/μL; 3,4: 1 ng/μL; 5,6: 100 pg/μL; 7,8: 10 pg/μL; M:2 000 bp Marker。

2.4 實(shí)際樣本檢測結(jié)果

基于Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系與PCR分別檢測實(shí)際樣本結(jié)果如圖8和圖9所示。在實(shí)際樣本的檢測中發(fā)現(xiàn),在納克級別的模板濃度下基于Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系在遇到3′突變的情況下基于其聚合反應(yīng)非成熟性終止能力無法進(jìn)行有效的擴(kuò)增，而PCR體系則能通過其3′→ 5′外切酶活性實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，無法停止反應(yīng)從而導(dǎo)致該反應(yīng)體系無法形成有效區(qū)分。結(jié)合該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知應(yīng)用Kenow(exo-)的RAA檢測體系具有單獨(dú)或聯(lián)合其他檢測技術(shù)來檢測SNP的潛在應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)我們也可以看到雖然結(jié)果符合預(yù)期，有部分非特異性條帶出現(xiàn)，說明蛋白的用量、反應(yīng)時(shí)間等尚有提高的空間,需進(jìn)一步優(yōu)化,也可考慮應(yīng)用熒光技術(shù)來實(shí)現(xiàn)最終檢測結(jié)果的判讀提高準(zhǔn)確度。

圖8 基于Klenow(exo-)蛋白的RAA檢測體系擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 RAA amplification results based on Klenow(exo-) protein.注：1,2:水牛10 ng/μL模板; 3,4:牦牛10 ng/μL模板; 5,6:水牛1 ng/μL模板; 7,8：牦牛1 ng/μL模板; M:2 000 bp Marker.

圖9 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.9 PCR amplification results.注：1,2:牦牛10 ng/μL模板; 3,4:牦牛1 ng/μL模板; 5,6:水牛10 ng/μL模板; 7,8：水牛1 ng/μL模板; M:2 000 bp Marker

3 討論

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對于單堿基多態(tài)性的重要性有了深入的了解，作為一種遺傳變異的分子標(biāo)記，其對于遺傳病研究、藥物開發(fā)等醫(yī)藥治療領(lǐng)域及生物學(xué)、農(nóng)學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科都有著廣泛的影響[8,9]。

利用高保真聚合酶來實(shí)現(xiàn)SNP檢測的想法由來已久，基于高保真聚合酶的錯(cuò)配切除效應(yīng)，研究人員提出了一些解決方案，其中最具典型意義的是單堿基敏感性分子復(fù)合開關(guān)技術(shù)[10]，然而該技術(shù)需要多輪巢式PCR進(jìn)行結(jié)果對比[11]，過程較為繁瑣，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。高保真 DNA 聚合酶具有通過聚合反應(yīng)非成熟性終止以維持成熟性終產(chǎn)物保真度的能力。尋找潛在的快捷檢測方法依舊是擺在我們面前的課題。利用去除外切酶活性的高保真聚合酶能否實(shí)現(xiàn)引物與模板不匹配的擴(kuò)增反應(yīng)的終止，一直是我們關(guān)注的另一個(gè)重要方面，也是實(shí)現(xiàn)高保真聚合酶直接檢測SNP的關(guān)鍵之處。Klenow片段是一種目前研究的比較透徹的具有3′→5′端外切酶活性的聚合酶[12]。Kelnow(exo-)聚合酶是在Klenow片段的基礎(chǔ)上對其活性部位進(jìn)行突變來實(shí)現(xiàn)3′→5′端外切酶活性,去除其D355A、E357A。突變后聚合酶只具有極小的3′→5′端外切酶活性,約為(1.4±0.5)×10-5U[13,14],因此在3′端堿基發(fā)生突變后，不能有效的進(jìn)行擴(kuò)增使反應(yīng)終止。利用這一原理結(jié)合重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增(RAA技術(shù))可以對SNPs位點(diǎn)進(jìn)行快速高效的鑒別。目前國內(nèi)對Klenow(exo-)制備的報(bào)道中其基因序列基本都是對Klenow酶進(jìn)行單個(gè)氨基酸的突變 ，這種方式使得Kelnow(exo-)聚合酶殘留的3′→5′端外切酶活性較高，降低了反應(yīng)終止的可靠性，另外現(xiàn)有報(bào)道的純化方法也只是進(jìn)行簡單的親和層析。這樣純化出來的蛋白純度較低，且會(huì)混有較高水平的核酸殘留，影響后續(xù)的恒溫?cái)U(kuò)增體系[15,16]。

通過Overlap獲得Klenow(exo-)基因并引入組氨酸標(biāo)簽，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以獲得高純度的Klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)量較高，純化工藝簡單，生產(chǎn)成本極低。結(jié)合RAA快速擴(kuò)增技術(shù)后能有效的對突變位點(diǎn)進(jìn)行鑒別，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看無論在質(zhì)粒檢測、還是實(shí)際樣本的檢測中均具有較好的特異性。然而由于目前暫時(shí)缺乏真實(shí)的臨床SNP樣本，盡管理論及類似實(shí)驗(yàn)可行,其靈敏度仍需進(jìn)一步提升。具體到真實(shí)的臨床樣本依然需要大量的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其是否有效和可靠[17]?？紤]到SNP快速檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用前景，任何希望能在該領(lǐng)域大展身手的技術(shù)必須兼?zhèn)淇焖俸透咄刻匦?。本技術(shù)結(jié)合熒光探針或側(cè)向流試紙條技術(shù)后有望只通過一臺便攜熒光檢測儀或一張檢測試紙條即可在常溫下20 min左右實(shí)現(xiàn)檢測，而且其反應(yīng)體系本身又比較易于高通量化，因此其應(yīng)用前景非常巨大[18,19]。因此，我們有理由相信圍繞Klenow(exo-)的RAA高靈敏度體系開發(fā)意義巨大且任重道遠(yuǎn)。