趙云霞, 江 魁, 郭愛英, 李景艷

1.華蘭生物工程股份有限公司, 河南 新鄉(xiāng) 453000;2.華蘭生物基因有限公司, 河南 新鄉(xiāng) 453000

肺炎鏈球菌是一種常見的病原微生物，其侵入人體可引起肺炎球菌綜合征[1]，免疫力低下的人群最易感，但最主要的易感人群是2歲以下嬰幼兒和60歲以上老人[2～4]。莢膜(多糖)存在于肺炎鏈球菌表面，與其侵襲力密切相關，將莢膜多糖與載體蛋白質結合，可增強嬰幼兒對細菌多糖的免疫反應，且具有重復接種記憶性及免疫增強作用。13價多糖結合疫苗，作為一種有效的預防類生物制品[5～9]，對肺炎類疾病的預防起著至關重要的作用。而多糖是多糖結合疫苗的主要有效成分，故多糖含量的測定是疫苗質量監(jiān)測的重要指標，是保障疫苗有效成分誘發(fā)免疫應答的基礎，因此，對于多糖含量進行檢測是疫苗質量控制的重要要求之一。

目前，實驗室采用的商品診斷血清有很多，但市售商品診斷血清在速率比濁法檢測多糖含量試驗中響應值比較低，線性不好，且價格昂貴，不適合實驗室長期、大量使用。因此，建立一種質優(yōu)、價廉的兔抗血清制備方法，對實驗室研究具有重要的意義。

本實驗基于文獻報道[10～13]和以往經驗，采用一種新的免疫原[1型多糖與CRM197載體蛋白質(不同于13價結合疫苗所用的TT載體蛋白質)制備的結合物]探索了一種簡易、穩(wěn)定性高的兔抗高效價血清制備方法，并對血清質量進行了驗證，建立了快速、大量制備合格質控血清的平臺，保證了研發(fā)進展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1動物 新西蘭白兔：2.5～3 kg/只，6只，雌雄不限，由華蘭生物疫苗有限公司動物中心提供。

1.1.2免疫用1型肺炎多糖結合物信息 自制1型肺炎多糖結合物，批號：JK01J-A201412001-1A；多糖濃度：262.2 μg/mL；載體蛋白CRM197濃度：136.4 μg/mL；多糖/蛋白：1.92。由華蘭生物疫苗有限公司動物中心提供。

1.1.3血清 1型肺炎球菌家兔診斷血清(商品診斷血清)：購自丹麥血清研究所(Statens Serum Institut，SSI)，貨號：16725。1型肺炎家兔兔抗血清(本文制備血清)：華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心制備，檢測合格分裝后于-70℃冷凍保存。

1.1.4樣品 1型肺炎球菌莢膜多糖購自丹麥血清研究所(Statens Serum Institut，SSI)，貨號為76851，多糖凍干樣品使用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液稀釋至 2 mg/mL，分裝至1.5 mL離心管，每管1 mL，于-20℃冷凍保存。破傷風類毒素(PncT)載體和CRM197載體均由華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心制備。1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型肺炎球菌結合物均為華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心制備。

1.1.5試劑 完全弗氏佐劑(貨號：F5881)、不完全弗氏佐劑(貨號：F5506)均購自Sigma公司。堿性磷酸酶標記羊抗兔 IgG 抗體(貨號：A0545)購自美國Sigma公司；CWP細胞壁多聚糖(貨號：9008-22-4)和22F(肺炎型別一種)多聚糖(貨號：1400742-41-7)購于丹麥國立血清研究所。與IMMAGE 800配套沖洗液：緩沖液1(貨號：447650)、稀釋液1(貨號：447640)購自美國BeckmanCoulter 公司。

1.2 儀器

多功能酶標儀:型號M2E，購自美國MD公司；特種蛋白分析系統(tǒng)：型號IMMAGE 800，購自貝克曼庫爾特公司。

1.3 實驗方法

1.3.1兔抗血清制備 采用肺炎多糖結合物(載體為CRM197)，在免疫動物前，將肺炎多糖結合物與弗氏佐劑(0 d一免時用完全弗氏佐劑，14 d二免時用不完全弗氏佐劑)1∶1進行乳化混勻，最終體積為2 mL/只，濃度為20 μg/mL。

取健康新西蘭白兔，0 d一免，抗原與完全弗氏佐劑1∶1進行乳化混勻，2 mL/只，皮下注射；14 d二免，抗原與不完全弗氏佐劑1∶1進行乳化混勻，2 mL/只，皮下注射；21 d加免，抗原不加佐劑，2 mL/只，耳緣靜脈注射；28 d加免，抗原不加佐劑，2 mL/只，耳緣靜脈注射，末次免疫1周后(第35 d) 進行家兔心臟采血，以免疫雙擴散法鑒別血清并確定其效價。留存鑒定樣本，其余分裝后-70℃冷凍保存。

1.3.2免疫雙擴散法 將完全溶脹的0.8%瓊脂糖溶液傾倒于水平玻板上(每平方厘米加0.19 mL瓊脂糖)，凝固后，打梅花孔，直徑3 mm，孔距3 mm(梅花形)，將 1.1.4中1型肺炎多糖(多糖濃度 600 μg/mL)抗原加入中央孔，肺炎待測血清(2倍系列稀釋，共6個稀釋度)加入周邊孔，檢測血清瓊擴效價。

這一次，鬼子的轟炸機沒敢低空盤旋，它們分批次地從高家?guī)X陣地的上空飛過，把成噸的炸彈投射下來。高家?guī)X的陣地上，再一次發(fā)出山搖地動的爆炸聲。隨著爆炸，泥土被掀起來，落下去，再被掀起來。山頂被削平了，戰(zhàn)士們剛剛修筑起來的戰(zhàn)壕被炸平了，好多防空的掩體也被炸塌了。夏國忠的那個掩體，被沙土埋得只剩下一條細縫。他吐著滿嘴的沙子，眼睛從那條細縫中看出去，罵道：“狗日的小鬼子，這是欺負老子沒有飛機呀?！?/p>

1.3.3ELISA間接檢測法 將1.1.4中1型多糖抗原及破傷風TT載體用包被液稀釋后進行包被，分別包被1 型多糖的酶標板及TT載體的酶標板，備用。以陰性對照的OD均值乘以2.1記為Cut off值，大于該值的最小OD值所對應的血清稀釋倍數為該血清的效價。

1.3.4速率比濁法 ①標準曲線的建立。在結合物1～6 μg/mL多糖濃度范圍內，分別將3次實驗中的各2 份血清以處理過的1型肺炎球菌結合物為對照品上機建立標準曲線，摸索出血清最適反應值的稀釋倍數。本實驗標準曲線成立標準設定為:儀器響應值在適當范圍內，相關系數R≥0.99，標線各點平行間CV≤10%。

②驗證肺炎型別特異性。將3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F共12型別肺炎球菌結合物的混合物(其中12型多糖濃度配制為與1型肺炎球菌結合物中多糖濃度相當，即與后續(xù)13價結合疫苗多糖濃度含量一致，除6B型為8 μg/mL外，其余均為4 μg/mL)，與1型肺炎球菌結合物分別作為IMMAGE 800儀器軟件編輯自定義項目(UDR)標準曲線上的2點，分析相同濃度條件下其13價肺炎多糖結合疫苗中除1型外其他12型別結合物存在條件下對1型多糖特異性檢測的影響。

③驗證速率比濁法試驗專屬性。將生理氯化鈉溶液、載體TT對照作為IMMAGE 800儀器軟件編輯自定義項目(UDR)標準曲線上的2點，探討1型多糖特異性檢測是否受肺炎結合物中載體蛋白質及空白溶液基質的影響。

④雙光徑速率濁度分析系統(tǒng)操作。選定IMMAGE 800儀器軟件中的UDR界面，選中1型檢測項目，儀器參數設置為非競爭性濁度模式，1型多糖結合物樣品設定為20 μL，1型兔抗血清20 μL，反應緩沖液200 μL，增益系數為4，反應時間為2.5 min。將建立標準曲線的各梯度肺炎多糖結合物，分別置于樣本杯，放在同一架(Rack)上，置于樣本區(qū)。再將驗證型別特異性及專屬性的4個樣本置于樣品杯，放置在另一樣本架上。

用移液槍將待測1型兔抗血清轉移至試劑盒A倉，嚴防氣泡出現，將試劑盒A倉密封蓋換為防蒸發(fā)蓋后置于試劑區(qū)。

2 結果與分析

2.1 1型肺炎兔抗血清免疫雙擴散結果

2.1.11型肺炎家兔診斷血清瓊擴實驗結果 中間孔加入1型多糖，作為抗原，自制1型肺炎兔抗血清(第一次實驗)與市售商品診斷血清2倍系列稀釋，免疫雙擴散檢測結果如圖1。

圖1 1型肺炎自制兔抗血清、商品診斷血清與相應1型多糖免疫雙擴散結果Fig.1 The results of double diffusion of rabbit antiserum, commercial serum and corresponding type 1 polysaccharide.注：中心孔： 1型肺炎多糖；第1孔：血清原液；第2孔：血清稀釋2倍； 第3孔：血清稀釋4倍；第4孔：血清稀釋8倍； 第5孔：血清稀釋16倍；第6孔：血清稀釋32倍。

圖1結果顯示:1型肺炎兔抗血清與相應1型多糖能夠產生明顯沉淀線的最大稀釋倍數均為16，商品診斷血清與相應1型多糖能夠產生明顯沉淀線的最大稀釋倍數為2，故自制1型兔抗血清瓊擴效價均為1∶16，1型肺炎商品診斷血清瓊擴抗體效價為1∶2。實驗結果表明，自制1型肺炎兔抗血清瓊擴效價在免疫雙擴散結果中優(yōu)于商品診斷血清。

2.1.2自制1型肺炎家兔兔抗血清免疫雙擴散結果 1型肺炎球菌莢膜多糖(CPS，多糖濃度600 μg/mL)抗原加入梅花孔的中央孔，1型肺炎待測血清(2倍系列稀釋，共6個稀釋度)加入周邊孔，檢測血清瓊擴效價(圖2)。

圖2結果顯示:前兩次實驗中，自制1型肺炎兔抗血清與相應1型多糖能夠產生明顯沉淀線的最大稀釋倍數均為16，故兩次試驗中用1型糖作為瓊脂擴散中心檢測出兩只動物血清瓊擴抗體效價均為1∶16。第3次實驗中，自制1型肺炎兔抗血清與相應1型多糖能夠產生明顯沉淀線的最大稀釋倍數分別為16和8，故試驗中用1型糖作為瓊脂擴散中心檢測出兩只動物血清瓊擴抗體效價分別為1∶16、1∶8。3次實驗兔抗血清瓊擴效價幾乎相當，血清制備質量穩(wěn)定。

2.2 1型肺炎兔抗血清ELISA 檢測結果

以1型商品診斷血清作為對照，自制肺炎兔抗血清分別于肺炎1型莢膜多糖或TT載體的ELISA反應結果見表1。表1結果顯示: 自制兔抗血清在ELISA 系統(tǒng)中針對1型多糖3次檢測結果平均效價滴度為94 500，比商品診斷血清略高。針對TT的3次檢測結果均值為467，比商品診斷血清略低。即自制兔抗血清針對TT載體的IgG 抗體滴度與針對1型多糖的IgG抗體滴度相比，低了約2個數量級。表明自制1型肺炎兔抗血清在進行ELISA滴度檢測時，1型多糖抗體與TT的非特異反應相比，自制血清特異性反應值遠遠高于TT載體非特異反應值，非特異性反應值基本可忽略不計。商品診斷血清與TT的非特異反應相比，滴度亦為其數百倍，但遠沒有自制兔抗血清TT非特異性干擾小，又由于商品診斷血清不易獲得、價貴，且在速率比濁實驗里響應值低，線性不好，故本實驗室建立了一種采用不同于13價結合疫苗中載體蛋白的肺炎多糖結合物制備大量、質優(yōu)兔抗血清的方法，作為疫苗過程及產品質控中免疫學方法的血清庫來源。

圖2 自制1型肺炎兔抗血清與相應1型多糖免疫雙擴散結果Fig.2 Immune double diffusion results of self-made rabbit antiserum against type 1 pneumonia and corresponding type 1 polysaccharide.注：中心孔： 1型肺炎多糖；第1孔：自制血清原液；第2孔：自制血清稀釋2倍； 第3孔：自制血清稀釋4倍；第4孔：自制血清稀釋8倍； 第5孔：自制血清稀釋16倍；第6孔：自制血清稀釋32倍。

表1 自制兔抗血清針對1型肺炎球菌莢膜多糖和TT的IgG抗體ELISA結果Table 1 ELISA results of IgG antibody against type 1 pneumococcal capsular polysaccharide and TT made by self-made rabbit antiserum.

2.3 1型兔抗血清速率比濁法檢測

2.3.1線性關系考察結果 用IMMAGE 800儀器自帶稀釋液1將處理過的結合物(6 μg/mL)進行稀釋，稀釋為1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL、5 μg/mL和6 μg/mL的6個濃度梯度，上機進行檢測定標，定標結束后，以多糖結合物濃度為X軸，儀器反應值為Y軸，進行線性回歸。求得回歸方程見表2。由此可知，該條件下多糖濃度在1～6 μg/mL范圍內，3次實驗中兔抗血清1、兔抗血清2均稀釋2倍時，線性關系可以被接納。

2.3.2速率比濁法對自制1型肺炎兔抗血清型別特異性及方法專屬性分析結果 我們采用以1型多糖與載體蛋白質(不同于13價結合疫苗所用載體) 制備的結合物來免疫家兔，3次實驗制備的高效價兔抗血清1、兔抗血清2均稀釋兩倍，多糖濃度在1～6 μg/mL范圍內，速率比濁法線性關系良好。但考慮到自制兔抗血清對整個疫苗制備過程質控的重要性，對3次實驗自制兔抗血清在速率比濁法中的特異性和專屬性進行了驗證，驗證結果見表3。

表2 線性關系考察結果Table 2 Results of linear relationship investigation.

表3 自制兔抗血清型別特異性及方法專屬性檢測結果Table 3 The results of method specificity and antiserotype specificity of self-made pneumonia.

表3結果顯示：在速率比濁法檢測系統(tǒng)中，3次實驗中自制兔抗血清1和自制兔抗血清2儀器響應值約高于空白對照及TT載體對照的10倍，并且也高于其他12型別結合物的10倍以上;故采用不同于多糖結合疫苗里載體蛋白的多糖結合免疫物與弗氏佐劑進行乳化免疫家兔所得的血清的特異性反應值遠遠高于型別交叉及載體、空白非特異反應值，故該自制兔抗血清滿足了速率比濁檢測系統(tǒng)的要求。

3 討論

本研究以自制1型肺炎多糖結合物為免疫物、采用前期摸索的免疫程序及劑量免疫家兔，制得高效價兔抗血清，且其比商品診斷血清更適合于速率比濁法檢測。運用已建立的瓊擴實驗法、ELISA法測定血清效價值，并在特異性方面較其他手段更優(yōu)的速率比濁法對兔抗血清進行質控，篩選出可用于后續(xù)結合疫苗及結合物制備過程中抗原含量測定的大量特異性兔抗血清，保證其多糖含量測定結果的準確性。

該方法不僅避免了多糖結合疫苗的多糖含量檢測時載體蛋白的干擾反應，快速、簡易獲得大量能用于速率比濁法檢測分析的家兔免疫血清，還大大降低了購買商品診斷血清的成本。目前，制備肺炎兔抗血清的方法很多，如用1型肺炎菌種免疫的方法，但由于1型肺炎菌種免疫的兔抗血清后續(xù)檢測干擾性太大，很難被直接用于質控血清，故本文采用以1型多糖與CRM197載體蛋白質(不同于13價結合疫苗里所用TT載體蛋白質)制備的結合物來免疫家兔，制備高效價兔抗血清。

由于13價肺炎結合疫苗中包含13種莢膜多糖抗原和載體蛋白質，血清抗體被用于各型多糖抗原含量測定有更高的質量要求[14]，故免疫學方法對多價結合疫苗的質控，是非常重要的[15]。近年來，速率比濁法被國內外廣泛用來檢測肺炎疫苗物多糖含量，該方法是利用抗原抗體特異性結合的免疫學動態(tài)測定法。不同于普通化學檢測方法無法準確區(qū)分各型肺炎球菌多糖，該方法更為精確，并有較高的靈敏度、特異性、精確性和速度快的特點[16,17]。故本研究中以速率比濁法對兔抗血清特異性和專屬性進行了驗證，驗證結果證明本實驗所制得的兔抗血清可以作為多糖結合疫苗研制中的質控血清。

肺炎球菌的血清型多達90種，1型為中國的流行株之一，注射結合疫苗不失為一種有效的預防手段，而多糖是其主要抗原成分，是疫苗效力實驗的替代指標[18]。本研究摸索出了一種簡易制備兔抗血清的方法，并對其在國內外常用的速率比濁方法中的血清型別特異性和檢測方法專屬性方面進行了驗證，為肺炎球菌結合疫苗中多糖含量的測定提供了足量合格的血清庫，并建立了評價血清的質控方法，為實驗室研究節(jié)約了大量成本。