杜夢潭, 劉興健, 胡小元, 張志芳, 李軼女

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

近幾十年來人類對自身基因組進(jìn)行了詳細(xì)探索，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個導(dǎo)致人類遺傳疾病的基因，新一代測序技術(shù)的發(fā)展極大的促進(jìn)了這一進(jìn)程，使得很多遺傳性疾病的相關(guān)基因得到了鑒定，傳統(tǒng)的手術(shù)和藥物并不能很好地治療這些疾病。因此，基因治療是一個正在飛速發(fā)展的學(xué)科，其通過病毒載體將正?；?qū)氲饺毕萁M織中，以替代或補償缺陷基因的功能，達(dá)到治療遺傳性或獲得性疾病的目的，其優(yōu)勢在于有望通過一次性方式治療疾病，解決根本問題。因此，基因治療相關(guān)的病毒載體也受到廣泛關(guān)注，主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒以及非病毒載體，各有其優(yōu)缺點[1]，其中，腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)載體因其低致命性、低免疫原性、宿主范圍廣泛且穩(wěn)定表達(dá)等獨特優(yōu)勢成為目前應(yīng)用最為廣泛的基因治療載體。

腺相關(guān)病毒是一種無包膜包被的單鏈DNA缺陷型病毒，最早于1965年作為腺病毒制備物中的一種污染成分被發(fā)現(xiàn)[2]。目前應(yīng)用于研究和臨床的是重組腺相關(guān)病毒載體(recombinant adeno-associated virus，rAAV)[3]。早在1996年，F(xiàn)lott等[4]將囊性纖維變性跨膜基因?qū)肴说暮粑啦@得表達(dá)且沒有任何不良反應(yīng)，至此，以AAV為病毒載體的基因治療開始成為研究熱點。但生產(chǎn)AAV載體的制造過程極其復(fù)雜，成本非常昂貴且限制因素多，成為整個行業(yè)的瓶頸，因此，急需開發(fā)更高滴度、更加經(jīng)濟(jì)的AAV載體制備技術(shù)，以滿足今后的臨床研究以及市場需求。本文就AAV的結(jié)構(gòu)和功能、載體的生產(chǎn)方式以及目前在基因治療中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，以期為今后AAV載體大規(guī)模應(yīng)用于市場提供參考。

1 腺相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)和功能

AAV病毒顆粒無包膜，結(jié)構(gòu)為直徑約20 nm的正二十四面體，其基因組為單鏈線性DNA，長約4.7 kb，包括兩個開放閱讀框和兩個末端反向重復(fù)序列(inverted terminal repeat, ITR)[5]。兩個開放閱讀框編碼4個Rep、3個Cap和1個APP蛋白(圖1),它們在AAV的潛伏期和感染期都起到了重要的作用。組成AAV的重要功能元件包括ITR序列、Rep、Cap蛋白和輔助病毒或者輔助病毒中的功能基因成分[7]。AAV的ITR由145個核苷酸組成，其中靠近末端的125個堿基是一個較長的回文結(jié)構(gòu)，自身能夠通過堿基互補配對進(jìn)行折疊，使得ITR呈現(xiàn)T字型的發(fā)卡結(jié)構(gòu)[8]，是AAV復(fù)制、包裝、整合所需的唯一順式作用元件。rep基因由AAV p5啟動子和p19啟動子啟動表達(dá)，編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，如圖1所示，其中，Rep78/68蛋白負(fù)責(zé)將病毒基因組在潛伏期整合進(jìn)宿主染色體中以及在感染期將其“拯救”，并在病毒顆粒包裝的過程中起著十分重要的作用，Rep52/40蛋白主要參與AAV基因組的組裝[9]。cap基因是由AAV基因組中的p40啟動子啟動，編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和APP蛋白，VP1和VP2對空的病毒外殼及完整病毒顆粒的裝配是必需的，APP蛋白促進(jìn)AAV基因組進(jìn)入病毒衣殼內(nèi)，促進(jìn)病毒顆粒的裝配與成熟[10]。

AAV作為一種復(fù)制缺陷型病毒，常用的輔助病毒包括腺病毒、巨細(xì)胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、猴皰疹病毒、牛痘病毒等，盡管不同的輔助病毒提供的基因并不相同，但都參與調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞基因的表達(dá)，使AAV能夠在一個比較寬松的細(xì)胞環(huán)境中增殖。目前，為AAV提供輔助功能的基因已經(jīng)確定，可以在無輔助病毒的條件下由一個質(zhì)粒提供，由于不需要活的輔助病毒，其提供了一個更安全、更便利的替代逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的基因傳遞系統(tǒng)[11]。

圖1 AAV的基因組結(jié)構(gòu)[6]Fig.1 Genome structure of AAV[6]

迄今為止，已經(jīng)找到來自人類的13種血清型，主要區(qū)別在于其衣殼蛋白Cap不同，對不同的組織和細(xì)胞有不同的感染效率[6]。AAV2是最早被發(fā)現(xiàn)和鑒定的血清型之一，在大多數(shù)的血清型中都有AAV2基因型的ITR序列；AAV1和AAV7主要靶向骨骼肌細(xì)胞；AAV3傾向于轉(zhuǎn)導(dǎo)巨核細(xì)胞；AAV5和AAV6對呼吸道上皮細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；AAV9由于其衣殼序列中的特異性氨基酸傾向于通過半乳糖與細(xì)胞結(jié)合，使其能夠跨越血腦屏障，傾向于感染中樞神經(jīng)細(xì)胞；AAV8基因型更傾向于有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟組織，這對于研究不同的疾病提供了方便性和可選性。

2 AAV載體的生產(chǎn)方式

AAV成為基因治療的載體之后，研究者們一直在不斷的摸索條件，以期得到一種穩(wěn)定的生產(chǎn)體系。是否能夠方便、大量的獲得需要的AAV載體是滿足臨床實驗的關(guān)鍵，生產(chǎn)成本是否低廉決定了其應(yīng)用和商業(yè)價值。目前，常用的載體制備方法主要有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系以及通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，各有其優(yōu)缺點(表1)。

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

表1 AAV載體的生產(chǎn)方式Table 1 Production method of AAV vecter.

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染加腺病毒感染或者質(zhì)粒直接感染宿主細(xì)胞生產(chǎn)rAAV病毒粒子。早在1984年的兩個研究組首先采用了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式來生產(chǎn)rAAV[12]，將兩個質(zhì)粒，一個是攜帶AAV 基因組中的ITR序列及外源基因的載體質(zhì)粒，另一個是攜帶rep、cap基因的包裝質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染由野生型腺相關(guān)病毒感染過的細(xì)胞，能夠大量表達(dá)外源基因；經(jīng)過Samulsi的改進(jìn)，用載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒與腺病毒共同感染HEK293細(xì)胞，收獲rAAV粒子[13]；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染加腺病毒感染的方法改進(jìn)之后的最高產(chǎn)量能夠達(dá)到109TU/mL(transducing units,TU轉(zhuǎn)導(dǎo)單位)[14]，由于易被野生型AAV污染，不便純化[15]， Xiao等[16]用三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)rAAV，將輔助病毒的功能基因克隆進(jìn)單獨的質(zhì)粒中，與載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，相比于傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，產(chǎn)量能夠達(dá)到103TU/cell[17,18]。

盡管質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法簡單易行，但該方法大規(guī)模應(yīng)用時需要大量的宿主細(xì)胞，無法滿足臨床研究和市場需求的大批量生產(chǎn)，且質(zhì)粒頻繁轉(zhuǎn)染會導(dǎo)致在傳代的過程中出現(xiàn)野生型AAV的污染，不易純化。

2.2 構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系

將AAV的rep、cap基因、攜帶ITR和目的基因的載體基因組和便于篩選的標(biāo)記基因同時整合到細(xì)胞中構(gòu)成細(xì)胞系，生產(chǎn)rAAV病毒粒子。1990年，Vicent等[19]首先建立了整合AAV基因組的細(xì)胞系，他們用只包含rep及cap基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，得到了幾個整合了低拷貝AAV基因組的細(xì)胞系，由于缺失了ITR，生產(chǎn)rAAV的能力較低；許多研究者采取其他策略來改進(jìn)rAAV的生產(chǎn)，Gao等[20]構(gòu)建了攜帶腺相關(guān)病毒載體成分的重組腺病毒，并用自身啟動子控制的含rep及cap基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞建立包裝細(xì)胞系，然后通過輔助腺病毒和攜帶載體成分的重組腺相關(guān)病毒共同感染包裝細(xì)胞系，從而產(chǎn)生rAAV病毒粒子；Farson等[21]通過對載體和細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使宿主細(xì)胞適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)，最高可達(dá)15 L的規(guī)模，實現(xiàn)了較大規(guī)模的生產(chǎn)。

但在實際操作中，穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建通常需要經(jīng)過大量的篩選以及不斷的鑒定，而且需要嚴(yán)格的生產(chǎn)能力評估才能得到符合要求的細(xì)胞系，其操作復(fù)雜性限制了其走向工業(yè)化。

2.3 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovirusexpression vector system, BEVS) 因其強(qiáng)啟動子、可以對表達(dá)的蛋白進(jìn)行加工修飾、且能夠擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，很早就被用來進(jìn)行rAAV的生產(chǎn)[22]，被 EMA 批準(zhǔn)進(jìn)入歐洲市場的 Glybera 就是用該系統(tǒng)生產(chǎn)的[4]，常用苜蓿銀紋夜蛾-桿狀病毒(AutographacalifornicaNucleopolyhedrovirus，AcNPV)表達(dá)系統(tǒng)和家蠶-桿狀病毒(BombyxmoriNucleopolyhedrovirus，BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)。

2.3.1苜蓿銀紋夜蛾-桿狀病毒(AcNPV)表達(dá)系統(tǒng) 早在幾十年前，BEVS已被用于工業(yè)中大量生產(chǎn)重組蛋白，該表達(dá)系統(tǒng)被證明是一種經(jīng)濟(jì)可行的平臺，開始用于生產(chǎn)rAAV病毒顆粒[23]。Urabe等[24]在2002年建立了三桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將rep、cap基因和rAAV的ITR序列及目的基因在草地貪夜蛾細(xì)胞系(Spodopterafrugiperdacell, sf細(xì)胞)中分別由不同的3種重組桿狀病毒載體來表達(dá)，且生產(chǎn)的病毒粒子結(jié)構(gòu)、功能均正常，但是由于rep基因轉(zhuǎn)錄沖突的問題，整個生產(chǎn)系統(tǒng)不穩(wěn)定，很難進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)；Smith等[25]進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計出二桿狀病毒包裝系統(tǒng)，此系統(tǒng)只包含rep、cap基因和目的基因兩個重組桿狀病毒載體，不僅能更好的保持桿狀病毒的穩(wěn)定性，使得桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的代數(shù)至少達(dá)到6代，同時還能提高了rAAV的生產(chǎn)效率；在此基礎(chǔ)上，Galibert 等[26]開發(fā)出的單桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將rep、cap基因和rAAV必需基因組分別插入AcNPV基因組的不同位點構(gòu)建一個重組桿狀病毒，這樣用一個重組病毒即可制備一種AAV載體，極大地提高了rAAV的包裝效率。

但是，上述AcNPV-sf細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由于細(xì)胞培養(yǎng)的成本偏高，導(dǎo)致病毒載體制備的價格昂貴。第一個商品化的AAV產(chǎn)品Glybera，它的單次治愈劑量的標(biāo)價最初高達(dá)160萬美元；美國獲批的AAV產(chǎn)品Luxturna的銷售定價為85萬美元。所以生產(chǎn)成本是限制AAV作為基因治療載體的關(guān)鍵因素之一。

2.3.2家蠶-桿狀病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng) 用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)rAAV是一個可行的選擇，從生產(chǎn)成本看，據(jù)報道，僅用 5 個蠶蛹的外源蛋白的表達(dá)量相當(dāng)于1 L昆蟲細(xì)胞的表達(dá)量[27]，在家蠶幼蟲的血淋巴中各類基因的表達(dá)量分別是sf細(xì)胞表達(dá)量的幾十倍甚至上百倍[28～30]。生產(chǎn)成本比細(xì)胞低幾百倍，而且昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于家蠶飼養(yǎng)成本。從安全性來看，家蠶作為鱗翅目昆蟲，已經(jīng)列入食品目錄，僵蠶作為我國傳統(tǒng)的名貴中藥，已經(jīng)被列入衛(wèi)生部中藥名錄，這些都表明用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)rAAV的安全性是有保證的，且已成功利用三桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)包裝出rAAV，經(jīng)過驗證，具有感染哺乳動物并驅(qū)動目的基因表達(dá)的能力，不僅具有AcNPV-sf系統(tǒng)的優(yōu)點，而且表達(dá)量更高，生產(chǎn)成本低幾百倍[31]，所以BmNPV-家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一個潛力巨大的rAAV生產(chǎn)系統(tǒng)。

3 重組腺相關(guān)病毒在基因治療中的應(yīng)用

基因治療相比于傳統(tǒng)藥物，具有較小的患者群體和潛在的治療效果。目前，很大一部分的基因治療針對的是罕見病，包括脂蛋白脂肪酶、人類遺傳性視網(wǎng)膜病變、血友病等等，已有超過2 000例的基因治療應(yīng)用于臨床試驗，其中超過68%是應(yīng)用病毒載體[32]。2007年1月1日-2019年3月20日，世界范圍內(nèi)開展的rAAV相關(guān)的臨床試驗共有117項(http://clinicaltrials.gov/),每年批準(zhǔn)的數(shù)量總體上呈現(xiàn)指數(shù)遞增趨勢(圖2)。并且rAAV所用載體的亞型也在增加，由單一的rAAV2擴(kuò)展到了rAAV1、rAAV5、rAAV8、rAAV9型，其中以rAAV1、rAAV2、rAAV8型相關(guān)的臨床試驗居多，分別為12項、59項和16項，治療的疾病范圍擴(kuò)展到艾滋病、癌癥、視網(wǎng)膜疾病、肌營養(yǎng)不良癥、心力衰竭、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及其他一些基因缺陷疾病，約25種。隨著不同血清型以及各種變體的改造，AAV在基因治療中的應(yīng)用越來越廣，為人類疾病的治療提供了新的思路。

圖2 rAAV相關(guān)臨床實驗情況Fig.2 Clinical trials related to rAAV.

目前已經(jīng)有兩種與AAV相關(guān)的基因治療藥物獲批上市，包括Glybera和 Luxturna，是基因治療領(lǐng)域最先被批準(zhǔn)的基因療法，是用于治療罕見病的一個歷史性開端。還有一項即將上市的基因治療藥物AMT-130，該藥是一個治療亨廷頓病的高度創(chuàng)新的方法。

2012年，基于AAV的商品Glybera被歐洲管理局(European Medicines Agency，EMA)批準(zhǔn)用于治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥(lipoprotein lipase deficiency, LPLD)，成為第一個正式批準(zhǔn)上市的人用AAV基因治療產(chǎn)品，脂蛋白脂肪酶缺乏癥是一種罕見的脂類代謝紊亂疾病，屬于常染色體隱性遺傳病，患者由于基因突變無法產(chǎn)生足夠的LPL分解乳糜顆粒，嚴(yán)重時會引發(fā)急性胰腺炎[33]。Glybera通過rAAV病毒載體將活性LPL基因整合進(jìn)肌細(xì)胞基因組，使這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生正常數(shù)量的LPL，但由于生產(chǎn)成本昂貴，售價仍高達(dá)120萬美元，2017年由于銷售情況堪憂，黯然退市。

2017年，美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)Luxturna 用于治療遺傳性視網(wǎng)膜疾??；該病是由于RPE65基因突變而導(dǎo)致的視覺功能減弱甚至喪失，Luxturna通過rAAV將正確的基因RPE65導(dǎo)入眼部，產(chǎn)生有功能的蛋白，恢復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞的功能，從而恢復(fù)喪失的視力。Luxturna曾獲得美國FDA頒發(fā)的孤兒藥資格與突破性療法認(rèn)定。但Luxturna定價為85萬美元，成為2017年在美國銷售最昂貴的藥物[34]。

2019年，AMT-130已被美國食品與藥物管理局(US Food and Drug Administration FDA)批準(zhǔn)開始治療亨廷頓病(Huntington’s Disease，HD)的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究[35]。亨廷頓病是一種罕見的、致命的神經(jīng)退行性遺傳疾病，是由常染色體顯性突變引起的，在亨廷頓基因的第一個外顯子中存在CAG三核苷酸的異常重復(fù)擴(kuò)增，導(dǎo)致大腦中突變蛋白聚集，表現(xiàn)為精神功能障礙終至癡呆。影響美國和歐洲大約70 000人，成為罕見疾病領(lǐng)域最大的臨床未解難題之一。盡管病因明確，但目前仍然缺乏可行的有效治療或延緩其發(fā)病的治療方案，AMT-130使用rAAV載體將人工miRNA直接遞送到大腦中敲低亨廷頓蛋白基因，這代表了治療HD的高度創(chuàng)新和有前途的方法。

近年來，基因治療正處于繁榮發(fā)展的時期，基于AAV載體的治療在臨床上顯現(xiàn)了令人印象深刻的結(jié)果，應(yīng)用也越來越廣泛。目前，大多數(shù)rAAV基因治療計劃集中于肝臟、橫紋肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，rAAV可以靶向肝臟治療各種疾病，包括血友病、家族性高膽固醇、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶缺乏癥；也能夠針對肌肉疾病開發(fā)rAAV基因療法；在臨床開發(fā)中，針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的rAAV用來治療脊髓型肌萎縮癥、多糖累積癥等影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，然而總體上rAAV基因藥物的臨床研究仍處于發(fā)展階段，存在著如純化、大規(guī)模制備、安全性評估等問題， rAAV載體在臨床方面進(jìn)一步發(fā)展需要考慮的問題是如何進(jìn)一步提高其治療效果，隨著對rAAV研究的深入，會有更多、更安全的rAAV載體出現(xiàn)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

4 展望

基因治療代表了治愈人類疾病的前沿技術(shù)之一，其中用rAAV作為載體的臨床實驗更是呈指數(shù)性增長，已有兩種rAAV相關(guān)的基因治療藥物被批準(zhǔn)進(jìn)入市場。AAV領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大將繼續(xù)推動基因治療藥物的開發(fā)，人類基因組計劃更是實現(xiàn)了對基因組近乎完整的注釋，使我們處于基因組學(xué)和基因治療時代的中間，研究者應(yīng)充分利用rAAV基因治療的前景并克服當(dāng)前挑戰(zhàn)，如生產(chǎn)成本較高等問題，其中家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)相比于其他載體制備方法安全性更高、生產(chǎn)成本更低，能夠為解決目前因成本過高而限制AAV載體在基因治療中應(yīng)用的問題提供一種新思路，但其后續(xù)產(chǎn)品的純化技術(shù)還需進(jìn)一步摸索。隨著rAAV在臨床上的不斷應(yīng)用，未來會著重加強(qiáng)載體優(yōu)化、改進(jìn)生產(chǎn)方式及效率，為其更好的應(yīng)用于基因治療打下基礎(chǔ)。