王萌萌，謝典，周育芳，李曉靜，徐步斌，周斌#（.江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，南昌00；.貴溪市羅河鎮(zhèn)人民政府農(nóng)綜站，江西貴溪 5400；.海軍勤務(wù)學(xué)院，天津 00450）

山慈菇系蘭科植物杜鵑蘭[Cremastra appendiculata（D.Don）Makino]、獨(dú) 蒜 蘭 [Pleione bulbocodioides（Franch.）Rolfe]或 云 南 獨(dú) 蒜 蘭（Pleione yunnanensisRolfe）的干燥假鱗莖，前者習(xí)稱“毛慈菇”，后二者習(xí)稱“冰球子”，為2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]收載的常用中藥。山慈菇味甘、微辛，性涼，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱解毒、化痰散結(jié)的功效，主要用于治療癰疽惡瘡、蛇蟲(chóng)咬傷、咽喉腫痛等癥[2]。藥理研究表明，山慈菇具有抗腫瘤[3-4]、抗菌[5]、降壓[6-8]等藥理活性。山慈菇主要含有菲類、聯(lián)芐類、黃酮類、糖及糖苷類等化學(xué)成分，而黃酮類成分是其有效成分之一，含量較高，藥用價(jià)值較大[9-14]。目前，有研究對(duì)山慈菇化學(xué)成分的提取分離和粗提物的藥效學(xué)等方面進(jìn)行了研究[15-16]。為更好地開(kāi)發(fā)、利用山慈菇資源，本研究采用超聲提取法提取了其總黃酮，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了山慈菇總黃酮的含量；以上述含量為指標(biāo)，通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝，旨在為其資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；FW80型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP225D型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

蘆丁對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YY90103，純度：≥98%）；亞硝酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、硝酸鋁（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、甲醇、乙醇（西隴化工股份有限公司）均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

山慈菇藥材采自云南省麗江市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鄧可眾副教授鑒定為山慈菇蘭科植物杜鵑蘭[Cremastra appendiculata（D.Don）Makino]的 干 燥 假鱗莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 山慈菇中總黃酮的含量測(cè)定

采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定山慈菇中總黃酮的含量[17]。

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品10.00mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取經(jīng)粉碎的山慈菇粉末（過(guò)30號(hào)篩）2.0 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加70%乙醇30 mL，超聲（功率：100 W，頻率：45 kHz）提取2次，每次45 min，合并濾液，搖勻。取5 mL，置于25 mL量瓶中，加50%乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分別置于25 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置5 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10mL，再加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。以70%乙醇為參比溶液，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁回歸方程為y＝0.012 7x+0.025 0（r＝0.999 7），表明蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為8～48 μg/mL。

2.1.4 定量限與檢測(cè)限考察 以70%乙醇為參比溶液，于510 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度并計(jì)算吸光度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線線性斜率之比的10倍為定量限，以標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線線性斜率之比的3倍為檢測(cè)限。結(jié)果，蘆丁的定量限、檢測(cè)限分別為0.54、0.18 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋后按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，再于510nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，吸光度的RSD為0.29%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫放置 0、4、8、12、16、24 h 時(shí)按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，再于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD為1.05%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末，共6份，每份約2.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，再于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中總黃酮的含量。結(jié)果，總黃酮的平均含量為2.64 mg/g，RSD為0.89%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品粉末，共6份，每份約2.0 g，精密稱定，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，再于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.1.9 樣品含量測(cè)定 取樣品粉末約2.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，再于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中總黃酮的含量，平行操作3次。結(jié)果，總黃酮含量為1.03～2.70 mg/g。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱取山慈菇粉末2.0 g，以“2.1.9”項(xiàng)下方法為手段，在料液比 1∶20（g/mL）、提取時(shí)間45 min、提取2次條件下，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、75%、80%）對(duì)山慈菇中總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1A。由圖1A可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，山慈菇中總黃酮的含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，含量最高，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為70%～80%。

圖1 單因素試驗(yàn)考察結(jié)果Fig 1 Results of single factor tests

2.2.2 料液比 精密稱取樣品粉末2.0 g，以“2.1.9”項(xiàng)下方法為手段，在70%乙醇、提取時(shí)間45 min、提取2次條件下，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40，g/mL）對(duì)山慈菇中總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1B。由圖1B可知，隨著乙醇用量的增加，山慈菇中總黃酮含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，含量最高，故選擇料液比范圍為1∶10～1∶20（g/mL）。

2.2.3 提取時(shí)間 精密稱取樣品粉末2.0 g，以“2.1.9”項(xiàng)下方法為手段，在70%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取2次條件下，考察不同提取時(shí)間（15、30、45、60、75 min）對(duì)山慈菇中總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1C。由圖1C可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，山慈菇中總黃酮含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為45、60 min時(shí)，含量最高，為節(jié)省時(shí)間，故選擇提取時(shí)間范圍為30～60 min。

2.2.4 提取次數(shù) 精密稱取樣品粉末2.0 g，以“2.1.9”項(xiàng)下方法為手段，在 70%乙醇，料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間45 min條件下，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4次）對(duì)山慈菇中總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1D。由圖1D可知，隨著提取次數(shù)的增加，山慈菇中總黃酮含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，但增加、降低幅度均較小，為節(jié)省時(shí)間和減少溶劑用量，故選擇提取次數(shù)范圍為1～3次。

2.3 山慈菇中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3 Design and results of experiment plan

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

由表3可知，各因素對(duì)山慈菇中總黃酮含量影響大小的順序?yàn)镈＞A＞B＞C，即提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間，其中 A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C2＞C3＞C1、D2＞D3＞D1。

由表4可知，提取次數(shù)具有顯著性影響（P＜0.05），而乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間均無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。

2.3.2 最優(yōu)提取工藝的確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 綜合考慮節(jié)約資源和成本，最終確定山慈菇中總黃酮的最優(yōu)提取工藝為A1B2C2D2，即70%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間45 min、提取次數(shù)2次。按此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行操作3次，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，優(yōu)化所得工藝條件穩(wěn)定、可行。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 5 Results of validation tests（n＝3）

3 討論

筆者在前期預(yù)試驗(yàn)中比較了加熱回流提取和超聲提取的效果。結(jié)果顯示，超聲提取所得總黃酮的含量顯著高于加熱回流提取，故選擇超聲提取法提取山慈菇中的總黃酮。該方法可節(jié)省溶劑和提取時(shí)間，且提取條件相對(duì)溫和，尤其適用于易氧化、易分解、熱不穩(wěn)定的物質(zhì)[18-19]。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了山慈菇中總黃酮的提取工藝條件。結(jié)果顯示，影響山慈菇總黃酮含量大小的因素順序?yàn)樘崛〈螖?shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間；優(yōu)化提取工藝條件為70%乙醇、料液比1∶20（g/mL）、提取時(shí)間45 min、提取次數(shù)2次，在此條件下山慈姑中總黃酮的平均含量為2.74 mg/g。

黃酮類化合物是山慈菇的有效成分之一，具有保護(hù)心血管、抗炎、抗菌、抗病毒等藥理作用[3-8，20-21]。本研究采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了山慈菇中總黃酮的含量，可為山慈菇中總黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，本研究所建含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確；所得提取工藝穩(wěn)定、可行。