徐彬 戴繼任 付勇

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院（杭州310052）

耳聾是人類(lèi)最常見(jiàn)的致殘性疾病之一。在世界范圍內(nèi),據(jù)統(tǒng)計(jì)新生兒先天性聾的發(fā)病率為1‰-3‰，50%患兒的耳聾與遺傳因素有關(guān)[1]。根據(jù)是否合并有其他系統(tǒng)或器官疾病，臨床上將遺傳性耳聾分為綜合征型聾(Syndromic Hearing Impairment,SHI)與非綜合征型聾(Non-Syndromic Hearing Impairment,NSHI)兩型。30%的遺傳性耳聾患者為SHI，70%為 NSHI。

Waardenburg綜合征（Waardenburg Syndrome，WS）又稱(chēng)聽(tīng)力-色素綜合征，是一種常見(jiàn)的染色體顯性遺傳綜合征遺傳性聾，WS發(fā)病率無(wú)明顯性別及種族差異，發(fā)病率占先天性耳聾患者的1%-3%，而人群發(fā)病率為1/42000[2]。WS具有高度的遺傳異質(zhì)性,主要臨床表現(xiàn)為感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失及色素分布異常，依據(jù)其伴隨癥狀的不同分為WSI、WSII、WSIII、WSIV四種類(lèi)型[3]，WSI臨床表現(xiàn)為先天性感音神經(jīng)性聽(tīng)力下降，色素異常及內(nèi)眥異位，指數(shù)W＞1.95[4]；WSII與WSI的區(qū)別就是無(wú)內(nèi)眥異位，W＜1.95[5]；WSIII除了WSI的臨床癥狀外，還伴有上肢畸形[6]；WSIV除了WSII的臨床表現(xiàn)外,同時(shí)伴有消化道的異常，例如先天性巨結(jié)腸或胃腸道閉鎖[7]。在Waardenburg綜合征患兒中，雖有虹膜異色，但無(wú)明顯的視力改變，且該疾病患兒的皮膚毛發(fā)色素分布異常也對(duì)其日常生活沒(méi)有明顯的影響，因此，此類(lèi)患兒常常因?yàn)槁?tīng)力問(wèn)題就診，WS患兒中約20%-55%伴有重度或極重度感音神經(jīng)性聾，占先天性聾兒的2%-5%[8]。

本研究對(duì)一Waardenburg綜合征家系進(jìn)行深入考察，采用高通量測(cè)序技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS）以及Sanger測(cè)序方法檢測(cè)該家系致病基因，并探討其可能性分子遺傳學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集來(lái)自浙江省溫州市的1個(gè)Waardenburg綜合征家系，命名為WZ-1家系，該家系共3代，現(xiàn)存家系成員21人，男女成員均有耳聾患者，系譜分析符合常染色體顯性遺傳規(guī)律，家系圖（圖1）。

圖1 WZ-1家系圖譜●■耳聾患者P↗■先證者Fig.1 Pedigree of family WZ-1●■deaf patients P↗■ proband

1.2 研究方法

1.2.1 病史及聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)

對(duì)該家系人員采集信息及抽取血樣前對(duì)家屬進(jìn)行宣教，告知其檢查的目的、意義，對(duì)自愿接受檢測(cè)者簽署知情同意書(shū)。登記其一般情況，詳細(xì)詢(xún)問(wèn)耳聾患者的發(fā)病年齡、是否存在誘因、耳聾的具體病變進(jìn)展情況，有無(wú)相關(guān)伴隨癥狀、既往有無(wú)外傷史、耳毒性藥物服用史、出生時(shí)有無(wú)宮內(nèi)缺氧及核黃疸等，在耳鼻喉科、眼科、皮膚科、消化內(nèi)科、骨科進(jìn)行系統(tǒng)的體格檢查，根據(jù)耳聾患者內(nèi)眥、外眥及瞳孔距離，計(jì)算W值。

先證者在我院行聲導(dǎo)抗、OAE、ABR、ASSR及顳骨CT、頭顱MRI等，排除顱腦占位性病變及智力障礙等。其家屬在我院及溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院完成相關(guān)體格檢查及聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)。

聽(tīng)力診斷標(biāo)準(zhǔn)參考WHO1997年日內(nèi)瓦會(huì)議推薦的聽(tīng)力損失分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。以純音測(cè)聽(tīng)為基礎(chǔ)，以較好耳0.5 、1.0、2.0、4.0kHz的聽(tīng)閾平均值為依據(jù)，將聽(tīng)力減退分為四個(gè)級(jí)別，即26～40dBHL為輕度聽(tīng)力損失；41～60dB HL為中度；61～80 dB HL為重度；≥81 dBHL為極重度。

1.2.2 基因檢測(cè)

抽取先證者及其家屬的外周血2-3ml，注入EDTA紫色抗凝管中，編號(hào)后送檢。先證者采用高通量測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)先證者的159個(gè)基因的外顯子區(qū)，6個(gè)線(xiàn)粒體基因，3個(gè)miRNA，再對(duì)先證者及其家屬進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

高通量測(cè)序流程如下:

①目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序

目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序的主要流程是利用捕獲芯片將目標(biāo)區(qū)域的DNA片段進(jìn)行富集后再借助高通量二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。本研究采用目標(biāo)序列捕獲芯片對(duì)已知的耳聾候選基因進(jìn)行捕獲。捕獲的具體過(guò)程如下：將基因組DNA隨機(jī)打斷成片段，與Illumina PE接頭寡核苷酸混合物鏈接，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鏈接介導(dǎo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LM-PCR）擴(kuò)增純化后得到DNA文庫(kù)，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，將上述PCR產(chǎn)物與目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片進(jìn)行雜交以富集目標(biāo)區(qū)域序列，借助Illumina Next 500測(cè)序平臺(tái)對(duì)捕獲的序列進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，包括圖像識(shí)別和樣本區(qū)分。

②生物信息分析

將原始測(cè)序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列，然后利用BWA軟件將過(guò)濾后的序列比對(duì)到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)人類(lèi)基因組參考序列（hg19）上，利用GATK軟件分析得出單核苷酸變異（SNV）和插入缺失突變（INDEL）的相關(guān)信息。然后通過(guò)ANNOVAR軟件對(duì)所有的SNP和INDEL進(jìn)行注釋。篩選掉正常人數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率小于0.05的突變位點(diǎn)，正常人數(shù)據(jù)庫(kù)包括千人基因組計(jì)劃、Exome Variant Server和EXAC。錯(cuò)義突變使用SIFT，PolyPhen-2 MutationTaster和GERP++軟件進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)和保守性預(yù)測(cè)，剪切位點(diǎn)的改變用SPIDEX軟件分析其致病性。

③PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序

經(jīng)過(guò)分析篩選得到的獲選變異位點(diǎn)利用PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證。PCR引物對(duì)利用Primer 3.0在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序并在ABI 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)上進(jìn)行分析。再在家系成員中進(jìn)行共分離驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 病史及輔助檢查結(jié)果

該家系共3代，現(xiàn)存家系成員21人，系譜分析符合常染色體顯性遺傳特征。參與本研究的耳聾患者6人，有語(yǔ)前聾和語(yǔ)后聾。外貌特征先證者（III:6）左側(cè)虹膜為亮藍(lán)色（圖3），內(nèi)眥間距正常,W＜1.95；其外公（I:3）頭發(fā)、眉毛稀疏，色白。家系聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示：先證者出生時(shí)聽(tīng)力篩查未通過(guò)，1月后復(fù)篩未通過(guò)，6月時(shí)聲導(dǎo)抗提示雙耳A型曲線(xiàn)，OAE提示雙耳均未通過(guò)，ABR及ASSR提示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，顳骨CT及頭顱MRI提示未見(jiàn)明顯異常；其余家屬聲導(dǎo)抗提示雙耳A型曲線(xiàn)，OAE提示雙耳均通過(guò)；媽媽?zhuān)↖I:8）為先天性極重度感音神經(jīng)性聾；爸爸（II:7）為極重度感音神經(jīng)性聾，出生時(shí)聽(tīng)力正常，2歲時(shí)感冒用藥后出現(xiàn)耳聾；舅舅(II:9)為輕度感音神經(jīng)性聾，發(fā)病時(shí)間不詳；外公為先天性極重度感音神經(jīng)性聾；外婆（I:4）為中度感音神經(jīng)性聾，5歲時(shí)發(fā)熱后才出現(xiàn)耳聾，其余家屬無(wú)耳聾病史（圖2及表1）。

圖2 WZ-1家系成員聽(tīng)力圖Fig.2 audiogram of family WZ-1

表1 WZ-1家系患者基本資料Table 1 Basic data of family WZ-1

圖3 先證者左側(cè)虹膜為亮藍(lán)色Fig.3 The proband's left iriswerebright blue

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

先證者通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)MITF（c.397G＞T）突變。后續(xù)經(jīng)一代測(cè)序驗(yàn)證,其母親、外公同樣存在MITF（c.397G＞T）突變。（圖4）。

圖4 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果A為先證者、C為先證者母親、E為先證者外公發(fā)現(xiàn)MITF（c.397G＞T）突變；B、D、F為先證者父親、舅舅、外婆相同位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)突變。Fig.4 Results of Sanger sequencingA III:6 has M ITF（c.397G＞T）mutation;B II:7 w ithout M ITF（c.397G＞T）mutation;C II:8 has M ITF（c.397G＞T）mutation;D II:9 w ithout M ITF（c.397G＞T）mutation;E I:3 has M ITF（c.397G＞T）mutation;FI:4 w ithout M ITF（c.397G＞T）mutation.

3 討論

WS的診斷主要標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）先天性感音神經(jīng)性耳聾；（2）虹膜色素異常：（3）頭發(fā)低色素改變，表現(xiàn)為額白發(fā)；（4）內(nèi)眥異位：W指數(shù)＞1.95；（5）一級(jí)親屬患病，滿(mǎn)足2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)就能確診WS[9]。該WS家系中先證者具有先天性極重度感音神經(jīng)性聾、左側(cè)亮藍(lán)色虹膜符合兩個(gè)WS主要診斷標(biāo)準(zhǔn)，患兒無(wú)內(nèi)眥異位：W指數(shù)＜1.95，排除WS I型，四肢無(wú)畸形活動(dòng)正常，排除WSIII型，顳骨CT、頭顱MRI提示未見(jiàn)異常，經(jīng)相關(guān)檢查排除先天性巨結(jié)腸和胃腸道閉鎖，排除WS IV型，先證者確診為WSII型。先證者外公先天性極重度感音神經(jīng)性聾、額白發(fā)符合兩個(gè)WS主要診斷標(biāo)準(zhǔn)，四肢無(wú)畸形活動(dòng)正常，無(wú)先天性巨結(jié)腸和胃腸道閉鎖，無(wú)內(nèi)眥異位：W指數(shù)＜1.95，同樣為WSII型。先證者母親先天性極重度感音神經(jīng)性聾、一級(jí)親屬患病符合一個(gè)WS主要診斷標(biāo)準(zhǔn)，四肢活動(dòng)無(wú)畸形活動(dòng)正常，無(wú)先天性巨結(jié)腸和胃腸道閉鎖，無(wú)內(nèi)眥異位：W指數(shù)＜1.95，亦為WSII型。

研究表明與WS相關(guān)的基因有6種：SOX10、PAX3、MITF、SNAI2、EDNRB和EDN3[10]。不同致病基因突變可導(dǎo)致不同WS亞型。研究表明約有15%～20%的WSII患者中檢測(cè)出MITF基因突變[11]。截止到2018年10月，人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳在線(xiàn)網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示已經(jīng)發(fā)現(xiàn)57種MITF基因雜合突變（https://www.omim.org/），大多數(shù)為錯(cuò)義突變和點(diǎn)突變，其次是移碼突變、剪切位點(diǎn)突變和小的缺失突變。這些突變主要分布在MITF基因第6～9號(hào)外顯子附近，其中點(diǎn)突變主要分布在7、8號(hào)外顯子，對(duì)應(yīng)于MITF蛋白的bHLH-Zip結(jié)構(gòu)域。Tas-sabehji在1994年通過(guò)對(duì)一個(gè)WS2大家系的研究發(fā)現(xiàn)MITF突變，并第一次克隆出了人類(lèi)MITF基因[12]。MITF是一種含有螺旋-環(huán)-螺旋堿性亮氨酸拉鏈（bHLH-Zip）結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，MITF通過(guò)bHLH-Zip結(jié)構(gòu)域與其他蛋白相互作用來(lái)協(xié)調(diào)靶基因的表達(dá)[13]。MITF可以促進(jìn)神經(jīng)嵴的黑色素細(xì)胞的分化，因此MITF突變能在許多物種中導(dǎo)致皮膚著色異常[14]。在內(nèi)耳中，來(lái)自神經(jīng)嵴的黑色素細(xì)胞存在于前庭和耳蝸。雖然他們?cè)谇巴サ淖饔眠€未知，但是在耳蝸中，他們發(fā)揮著重要的作用。MITF基因突變導(dǎo)致耳蝸血管紋黑色素細(xì)胞的缺失，導(dǎo)致耳蝸內(nèi)淋巴液鉀離子濃度降低，內(nèi)淋巴液鉀離子濃度的降低會(huì)影響毛細(xì)胞對(duì)聲音的反應(yīng)，最終產(chǎn)生耳聾[15]。

該Waardenburg綜合征家系中的三位WSII型患者，先證者通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)MITF（c.397G＞T）突變，后續(xù)經(jīng)一代測(cè)序驗(yàn)證，其母親、外公同樣存在MITF（c.397G＞T）突變。先證者、其母親、外公均有MITF基因第4個(gè)外顯子c.397G＞T雜合突變，編碼區(qū)第397號(hào)核苷酸由鳥(niǎo)嘌呤變異為胸腺嘧啶，該突變極可能是終止大突變，在HGMD專(zhuān)業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)報(bào)道。報(bào)告中的MITF基因轉(zhuǎn)錄本NM_000248，Coding Excon（即外顯子長(zhǎng)度，只包含外顯子，不包含UTR和內(nèi)含子）長(zhǎng)度1269bp，共編碼422個(gè)氨基酸，先證者氨基酸變化p.E133X，由原來(lái)的編碼422個(gè)氨基酸，該突變極可能是終止大突變，最終只能編碼132個(gè)氨基酸，導(dǎo)致290個(gè)氨基酸無(wú)法編碼表達(dá)，極大的影響了蛋白的表達(dá)。該家系中先證者外公將致病基因傳給了先癥者母親，其母親又將致病基因遺傳給了先證者。先證者母親、外公均、先證者均為MITF基因雜合突變，并出現(xiàn)WSII癥狀，符合常染色體顯性遺傳的特點(diǎn)，有50%的風(fēng)險(xiǎn)將該致病基因遺傳給后代，再生育耳聾患者的風(fēng)險(xiǎn)極高，建議行產(chǎn)前診斷。先證者左耳進(jìn)行了人工耳蝸植入術(shù)，康復(fù)訓(xùn)練3月左右喚其姓名能做出反應(yīng)，目前已經(jīng)將近2年的言語(yǔ)康復(fù)訓(xùn)練，能與老師或其密切接觸者進(jìn)行一些簡(jiǎn)單的互動(dòng)，可以說(shuō)出2-3字簡(jiǎn)單詞匯。

本研究通過(guò)NGS對(duì)WSII家系進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MITF（c.397G＞T）突變，該突變極可能是終止大突變，在HGMD專(zhuān)業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)報(bào)道,為國(guó)際首次報(bào)道，豐富了MITF致病突變譜系。