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        成年灘羊和小尾寒羊皮膚毛囊差異表達(dá)miRNA 的篩選

        2019-08-12 05:03:32何玉龍莊仁杰周學(xué)章吳月紅
        中國畜牧雜志 2019年8期
        關(guān)鍵詞:灘羊小尾寒羊毛囊

        何玉龍,楊 瑞,莊仁杰,李 勇,周學(xué)章,吳月紅*

        (1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院,浙江杭州 310018;2.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,寧夏銀川 750021;3.浙江理工大學(xué)校醫(yī)院,浙江杭州 310018)

        被毛生長是一個復(fù)雜的生理過程,受環(huán)境、營養(yǎng)、代謝及基因調(diào)控等因素影響,其中基因調(diào)控是決定性因素[1]。從基因水平上揭示綿羊被毛生長特點(diǎn)對于改良其品質(zhì)具有重要價值。MicroRNAs(miRNAs)在調(diào)控基因表達(dá)方面起重要作用。隨著綿羊相關(guān)miRNA 的不斷發(fā)現(xiàn),其在皮膚毛囊中的表達(dá)也逐漸受到重視,可能在皮膚毛囊發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[2-5]。

        小尾寒羊具有生長速度快、產(chǎn)羔率高、性能遺傳穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn),是我國北方地區(qū)的優(yōu)勢綿羊品種[6-7]。利用小尾寒羊生產(chǎn)裘皮的歷史悠久,但隨著市場需求的變化,小尾寒羊逐步向肉用方向選育[8]。在提高小尾寒羊肉產(chǎn)量的同時,加強(qiáng)裘皮性狀品系的選育具有重要意義。但由于目前并未將小尾寒羊毛用性狀作為主要育種目標(biāo),導(dǎo)致其毛用性狀未有明顯提高[7,9]。灘羊主要分布在寧夏及其毗鄰地區(qū),是中國唯一生產(chǎn)“二毛裘皮”的綿羊品種[10]。目前,關(guān)于灘羊[11]和小尾寒羊[12]皮膚毛囊組織中miRNA 的研究已有報道,但關(guān)于兩者皮膚毛囊中miRNA 的比較研究未見報道。為了解灘羊與小尾寒羊在裘皮性能差異的分子機(jī)制,本研究通過高通量測序技術(shù)比較灘羊與小尾寒羊皮膚毛囊中miRNA 差異,對于從miRNA 水平上解析皮毛性狀形成的分子機(jī)理具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 樣品采集 灘羊來源于寧夏回族自治區(qū)吳忠市紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司,小尾寒羊來源于內(nèi)蒙古察哈爾右翼中旗某養(yǎng)殖戶,分別采集成年灘羊(命名為TY_1)和小尾寒羊(命名為XWHY_1)各3只,每組個體的樣品混合組成樣品池。樣品采集時間為2015 年2—3 月。剪毛消毒后用手術(shù)剪刀剪取背部相同位置約3~5 cm2皮膚組織,去除皮下脂肪組織等,剪成約0.5~1.0 cm2小塊,PBS 溶液清洗后投入RNA 保護(hù)劑RNAlater(Thermo Fisher Scientific,美國)中。冷藏條件下盡快帶回實(shí)驗室,-80℃冰箱保存。

        1.2 總RNA 提 取、小RNA 文 庫 構(gòu) 建 及Solexa 測 序?qū)颖居靡旱浞盅心ズ?,利用Trizol 試劑(Invitrogen,美國)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行皮膚組織總RNA 的提取,得到的總RNA 分別采用Nanodrop2000(美國)、Qubit 2.0(美國)和Agilent 2100 分析儀(美國)檢測其純度、濃度和完整性。樣品檢測合格后,以總RNA為起始樣品,使用small RNA Sample Pre Kit 試劑盒(Illumina ,美國)構(gòu)建文庫,首先在small RNA 5'端和3' 端連接接頭,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR 擴(kuò)增后利用PAGE 膠電泳篩選目的片段,切膠回收得到的片段即為small RNA 文庫。質(zhì)控合格后,利用HiSeq2500 進(jìn)行高通量測序,測序讀長為single-end(SE)50 nt。

        1.3 測序數(shù)據(jù)分析 按照標(biāo)準(zhǔn)的miRNA 測序分析流程進(jìn)行測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計、小RNA 分類注釋、已知miRNA的鑒定、新發(fā)現(xiàn)miRNA 的預(yù)測、miRNA 表達(dá)量及差異表達(dá)分析、差異表達(dá)miRNA 靶基因預(yù)測及注釋等。

        1.4 實(shí)時熒光定量PCR 驗證miRNA 測序結(jié)果 為驗證測序結(jié)果的可靠性,對鑒定出的miRNA 進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 檢測驗證。以總RNA 為初始模板,隨機(jī)選取4 個miRNAs,miRNAs 反轉(zhuǎn)錄引物為通用頸環(huán)序列(GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGAC)和目標(biāo)miRNA 3' 末端6 個堿基的反向互補(bǔ)序列構(gòu)成。使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(Thermo Fisher Scientific,美國)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行cDNA 第一鏈合成,使用SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒(TaKaRa,大連)進(jìn)行qRT-PCR驗證,以U6 為內(nèi)參基因。miRNA 相對表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計算。miRNA 熒光定量PCR 引物見表1。所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

        表1 實(shí)時熒光定量PCR 引物

        1.5 差異表達(dá)miRNA 的篩選、靶基因預(yù)測及參與信號通路分析 利用IDEG6 對上述鑒定出的miRNAs 進(jìn)行表達(dá)差異分析,選擇差異表達(dá)的miRNAs,分別使用miRanda 和RNAhybrid 軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測。對差異表達(dá)miRNA 的靶基因進(jìn)行基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 小RNA 文庫序列統(tǒng)計 如表2 所示,灘羊(TY_1)和小尾寒羊(XWHY_1)樣品分別通過HiSeq 2500 高通量測序,產(chǎn)出的原始數(shù)據(jù)(Raw reads)數(shù)量大于16.35 million(M),對其進(jìn)行去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、5'接頭、3'接頭及污染等處理后,樣品中過濾后序列所占的比例分別為85.68% 和87.38%,質(zhì)量值≥30 的堿基所占比例(Q30)分別為95.37%和95.40%。

        表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

        2.2 sRNA 分類注釋 利用Bowtie 軟件將上述過濾后數(shù)據(jù)分別與Silva、GtRNAdb、Rfam 和Repbase 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對,過濾核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、核內(nèi)小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)等非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)以及重復(fù)序列,在TY_1 和XWHY_1 樣品分別獲得包含miRNA 的未注釋的reads(Unannotated reads)10 852 746 和14 135 887,用于后續(xù)分析,結(jié)果見表3。

        表3 sRNA 分類注釋統(tǒng)計

        2.3 與參考基因組比對 利用miRDeep2 軟件將上述未注釋Reads 與參考綿羊基因組(Oar_v3.1)進(jìn)行序列比對分析,獲取其在參考基因組上的位置信息。如表4 所示,TY_1 和XWHY_1 樣品比對到綿羊基因組的比例分別為52.14% 和51.22%,說明50% 以上的Reads 能比對到綿羊基因組上。

        表4 與參考基因組比對信息統(tǒng)計表

        2.4 miRNA 的鑒定 對于上述比對到參考基因組的序列,利用miRDeep2 軟件進(jìn)行已知及新發(fā)現(xiàn)miRNA的鑒定。即將18~30 nt 的核苷酸序列比對到miRBase(V21.0)數(shù)據(jù)庫中特定物種上,鑒定其已知的miRNA。對于未比對到參考基因組的序列,通過堿基數(shù)目延伸,進(jìn)行miRNA 結(jié)構(gòu)預(yù)測,獲得新發(fā)現(xiàn)miRNA(novel miRNAs)。經(jīng)過比對共檢測到561 個miRNAs,其中包括138 個已知miRNAs 和423 個新發(fā)現(xiàn)miRNAs。

        2.5 miRNA 的長度分析 對2 個樣本中鑒定到的138個已知miRNA 和423 個新發(fā)現(xiàn)miRNA 進(jìn)行核苷酸長度統(tǒng)計。如圖1 所示,大部分miRNA 序列長度在20~24 nt,已知miRNA 和新發(fā)現(xiàn)miRNA 中所占比例分別為96.38%和95.98%。其中長度為22 nt 的序列所占比例最高,分別為42.75%和51.54%;其次為21 nt 和23 nt,其長度分布符合Dicer 酶切割的典型特征,說明測序結(jié)果質(zhì)量可靠,可用于后續(xù)分析。

        圖1 miRNA 長度分布

        2.6 miRNA 表達(dá)量分析對TY_1和XWHY_1樣本中鑒定出的miRNA 進(jìn)行表達(dá)量分析,并用TPM 算法對表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。TPM 歸一化處理公式:TPM=Readcount×1000000/Mapped Reads。其中,Readcount表示比對到某一miRNA 的reads 數(shù)目;Mapped Reads表示比對到參考基因組上的reads 數(shù)目。部分表達(dá)量較高的已知miRNA 如表5 所示。oar-let-7 家族在TY_1和XWHY_1 樣本中表達(dá)量均較高。

        表5 部分高表達(dá)已知miRNA 表達(dá)量數(shù)據(jù)(前20 位)

        2.7 miRNA qRT-PCR 驗證 隨機(jī)選取4 個miRNA,通過qRT-PCR 的方法驗證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性,結(jié)果如圖2 所示。通過比較qRT-PCR 與高通量測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表6),這4 個miRNA 在TY_1 和XWHY_1 中表達(dá)的變化趨勢基本一致,證明高通量測序結(jié)果的可靠性。

        圖2 miRNA 的qRT-PCR 驗證分析

        表6 用于qRT-PCR 驗證的miRNA 測序表達(dá)量數(shù)據(jù)

        2.8 差異表達(dá)miRNA 分析 利用IDEG6 對上述鑒定出的miRNAs 進(jìn)行表達(dá)差異篩選,獲得TY_1 與XWHY_1樣品間差異表達(dá)的miRNA,篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2(FC)|Co且FDRg2 為71,其中FC 為差異倍數(shù)(Fold Change);FDR 為錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate)。結(jié)果在樣品TY_1 與XWHY_1 共篩選到63 個上調(diào)miRNAs 和16個下調(diào)miRNAs。進(jìn)一步對在2 個樣品中差異表達(dá)的79個miRNAs 進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)43 個為已知miRNA,36 個為新發(fā)現(xiàn)miRNA。最后對43 個差異表達(dá)的已知miRNA進(jìn) 行 聚 類 分 析( 圖3),oar-miR-127、oar-miR-379-5p、oar-miR-10a、oar-miR-411a-5p 和oar-miR-493-5p等在TY_1 和XWHY_1 樣品中表達(dá)量均較高,而oarmiR-376 家族(包括oar-miR-376b、c、d 和e)和oarmiR-3959-3p 在2 個樣品中的表達(dá)量差異較顯著(差異倍數(shù)大于4),提示其可能在不同品種綿羊皮膚毛囊發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。

        2.9 差異表達(dá)miRNA 靶基因預(yù)測及富集分析 根據(jù)篩選到的差異表達(dá)miRNA 與綿羊的基因序列信息,用miRanda 和RNAhybrid 軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測。使用BLAST 軟件將預(yù)測靶基因序列與GO 和KEGG 等數(shù)據(jù)庫比對,獲得靶基因的注釋信息分別為3 886 和4 449個。最后對樣品TY_1 和XWHY_1 間差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 中通路類型分類統(tǒng)計,GO 統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)其主要參與代謝過程、催化活性、細(xì)胞進(jìn)程和細(xì)胞組分等過程(圖4);KEGG 通路的結(jié)果表明,差異表達(dá)miRNA 的4 449 個靶基因富集到113個信號通路上,其中在嘌呤代謝、內(nèi)吞作用和糖酵解/糖異生等信號通路上富集顯著性較高。

        3 討 論

        皮膚毛囊的生長發(fā)育受到多個信號分子及信號通路的協(xié)同調(diào)控,是一個復(fù)雜的分子調(diào)控過程[13]。從miRNA 的角度簡析綿羊皮膚毛囊生長發(fā)育的機(jī)制,對于最終從分子水平上揭示綿羊皮膚毛囊形成的分子機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制具有重要作用。

        有研究證實(shí),灘羊在1 月齡時可宰取理想的羔皮,而小尾寒羊從胎內(nèi)到3 或4 月齡都可宰取理想的羔皮[14]。為探討這種差異形成的分子機(jī)制,本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)分析比較了TY_1 和XWHY_1 皮膚毛囊組織中的miRNA 表達(dá)差異。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去低質(zhì)量、去污染和去接頭等一系列處理,在灘羊和小尾寒羊皮膚毛囊組織樣品中分別得到16 350 847 個和17 891 155 個高質(zhì)量序列讀數(shù)。通過與miRBase 數(shù)據(jù)庫(V21.0)比對,在2 個樣品中共鑒定出561 個miRNA,其中138 個為已知miRNA,423 個為新發(fā)現(xiàn)miRNA。通過篩選TY_1 與XWHY_1 間差異表達(dá)miRNA 發(fā)現(xiàn)63 個為上調(diào)miRNAs,16 個為下調(diào)miRNAs。這些差異表達(dá)miRNA中43 個為已知miRNA,36 個為新發(fā)現(xiàn)miRNA。

        圖3 差異表達(dá)的已知綿羊miRNA 聚類分析

        圖4 差異表達(dá)miRNA 靶基因的基因本體(GO)富集分析

        相對于妊娠45 d 的絨山羊,在妊娠55 d 和65 d 樣本中oar-let-7 和oar-miR-200 家族的miRNA 表達(dá)量都顯著上調(diào),提示其可能是毛囊發(fā)育中關(guān)鍵的miRNA[15]。而在本研究中前20 個高表達(dá)的已知miRNA 中oar-let-7 家族有5 個,分別為oar-let-7f、oar-let-7a、oar-let-7g、oarlet-7i 和oar-let-7c;而oar-miR-200 家族有2 個,分別為oar-miR-200b 和oar-miR-200c。 另 外,oar-miR-200 家族在羊駝皮膚和毛囊發(fā)育中也可能起重要作用[16]。已有研究報道,oar-miR-30a-5p 和oar-miR-23a 等可通過調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1(Silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT 1)參與羊毛卷曲生長[17],而在本研究中也檢測到oar-miR- 30a-5p和oar-miR-23a 的高表達(dá),提示其可能參與小尾寒羊和灘羊毛發(fā)卷曲生長。另外,本研究在灘羊和小尾寒羊皮膚中檢測到高水平表達(dá)的oar-miR-125b 在羊駝背部皮膚中表達(dá)量也較高[16]。與小尾寒羊相比,在灘羊皮膚毛囊中高水平表達(dá)的oar-miR-127 和oar-miR-379-5p,在藏綿羊皮膚毛囊中也檢測到[18]。而oar-miR-376 家族(包括oar-miR-376b、c、d 和e)和oar-miR-3959-3p在2 個樣品中的表達(dá)量差異最顯著(差異倍數(shù)大于4),提示其可能在不同品種綿羊皮膚毛囊發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。GO 統(tǒng)計差異表達(dá)miRNA 的靶基因發(fā)現(xiàn),其主要參與代謝過程、催化活性、細(xì)胞進(jìn)程和細(xì)胞組分等過程;KEGG 通路的結(jié)果表明,差異表達(dá)miRNA 的靶基因主要富集到嘌呤代謝、內(nèi)吞作用和糖酵解/糖異生等信號通路上。

        4 結(jié) 論

        本實(shí)驗利用高通量測序技術(shù)在灘羊和小尾寒羊皮膚毛囊組織中篩選得到了79 個差異表達(dá)的miRNAs,并對其靶基因進(jìn)行預(yù)測,推測其可能參與了綿羊皮膚毛囊發(fā)育的調(diào)控,但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步驗證。

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