何玉龍，楊 瑞，莊仁杰，李 勇，周學(xué)章，吳月紅*

（1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江杭州 310018；2.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021；3.浙江理工大學(xué)校醫(yī)院，浙江杭州 310018）

被毛生長是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，受環(huán)境、營養(yǎng)、代謝及基因調(diào)控等因素影響，其中基因調(diào)控是決定性因素[1]。從基因水平上揭示綿羊被毛生長特點(diǎn)對于改良其品質(zhì)具有重要價(jià)值。MicroRNAs（miRNAs）在調(diào)控基因表達(dá)方面起重要作用。隨著綿羊相關(guān)miRNA 的不斷發(fā)現(xiàn)，其在皮膚毛囊中的表達(dá)也逐漸受到重視，可能在皮膚毛囊發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[2-5]。

小尾寒羊具有生長速度快、產(chǎn)羔率高、性能遺傳穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國北方地區(qū)的優(yōu)勢綿羊品種[6-7]。利用小尾寒羊生產(chǎn)裘皮的歷史悠久，但隨著市場需求的變化，小尾寒羊逐步向肉用方向選育[8]。在提高小尾寒羊肉產(chǎn)量的同時(shí)，加強(qiáng)裘皮性狀品系的選育具有重要意義。但由于目前并未將小尾寒羊毛用性狀作為主要育種目標(biāo)，導(dǎo)致其毛用性狀未有明顯提高[7,9]。灘羊主要分布在寧夏及其毗鄰地區(qū)，是中國唯一生產(chǎn)“二毛裘皮”的綿羊品種[10]。目前，關(guān)于灘羊[11]和小尾寒羊[12]皮膚毛囊組織中miRNA 的研究已有報(bào)道，但關(guān)于兩者皮膚毛囊中miRNA 的比較研究未見報(bào)道。為了解灘羊與小尾寒羊在裘皮性能差異的分子機(jī)制，本研究通過高通量測序技術(shù)比較灘羊與小尾寒羊皮膚毛囊中miRNA 差異，對于從miRNA 水平上解析皮毛性狀形成的分子機(jī)理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 灘羊來源于寧夏回族自治區(qū)吳忠市紅寺堡區(qū)天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司，小尾寒羊來源于內(nèi)蒙古察哈爾右翼中旗某養(yǎng)殖戶，分別采集成年灘羊（命名為TY_1）和小尾寒羊（命名為XWHY_1）各3只，每組個(gè)體的樣品混合組成樣品池。樣品采集時(shí)間為2015 年2—3 月。剪毛消毒后用手術(shù)剪刀剪取背部相同位置約3～5 cm2皮膚組織，去除皮下脂肪組織等，剪成約0.5～1.0 cm2小塊，PBS 溶液清洗后投入RNA 保護(hù)劑RNAlater（Thermo Fisher Scientific，美國）中。冷藏條件下盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱保存。

1.2 總RNA 提 取、小RNA 文 庫 構(gòu) 建 及Solexa 測 序?qū)颖居靡旱浞盅心ズ?，利用Trizol 試劑（Invitrogen，美國）按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行皮膚組織總RNA 的提取，得到的總RNA 分別采用Nanodrop2000（美國）、Qubit 2.0（美國）和Agilent 2100 分析儀（美國）檢測其純度、濃度和完整性。樣品檢測合格后，以總RNA為起始樣品，使用small RNA Sample Pre Kit 試劑盒（Illumina ，美國）構(gòu)建文庫，首先在small RNA 5'端和3' 端連接接頭，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 擴(kuò)增后利用PAGE 膠電泳篩選目的片段，切膠回收得到的片段即為small RNA 文庫。質(zhì)控合格后，利用HiSeq2500 進(jìn)行高通量測序，測序讀長為single-end（SE）50 nt。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析 按照標(biāo)準(zhǔn)的miRNA 測序分析流程進(jìn)行測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、小RNA 分類注釋、已知miRNA的鑒定、新發(fā)現(xiàn)miRNA 的預(yù)測、miRNA 表達(dá)量及差異表達(dá)分析、差異表達(dá)miRNA 靶基因預(yù)測及注釋等。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證miRNA 測序結(jié)果 為驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性，對鑒定出的miRNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測驗(yàn)證。以總RNA 為初始模板，隨機(jī)選取4 個(gè)miRNAs，miRNAs 反轉(zhuǎn)錄引物為通用頸環(huán)序列（GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGAC）和目標(biāo)miRNA 3' 末端6 個(gè)堿基的反向互補(bǔ)序列構(gòu)成。使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行cDNA 第一鏈合成，使用SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒（TaKaRa，大連）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，以U6 為內(nèi)參基因。miRNA 相對表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。miRNA 熒光定量PCR 引物見表1。所有引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物

1.5 差異表達(dá)miRNA 的篩選、靶基因預(yù)測及參與信號(hào)通路分析 利用IDEG6 對上述鑒定出的miRNAs 進(jìn)行表達(dá)差異分析，選擇差異表達(dá)的miRNAs，分別使用miRanda 和RNAhybrid 軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測。對差異表達(dá)miRNA 的靶基因進(jìn)行基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小RNA 文庫序列統(tǒng)計(jì) 如表2 所示，灘羊（TY_1）和小尾寒羊（XWHY_1）樣品分別通過HiSeq 2500 高通量測序，產(chǎn)出的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）數(shù)量大于16.35 million（M），對其進(jìn)行去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、5'接頭、3'接頭及污染等處理后，樣品中過濾后序列所占的比例分別為85.68% 和87.38%，質(zhì)量值≥30 的堿基所占比例（Q30）分別為95.37%和95.40%。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 sRNA 分類注釋 利用Bowtie 軟件將上述過濾后數(shù)據(jù)分別與Silva、GtRNAdb、Rfam 和Repbase 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，過濾核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）、核內(nèi)小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）等非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）以及重復(fù)序列，在TY_1 和XWHY_1 樣品分別獲得包含miRNA 的未注釋的reads（Unannotated reads）10 852 746 和14 135 887，用于后續(xù)分析，結(jié)果見表3。

表3 sRNA 分類注釋統(tǒng)計(jì)

2.3 與參考基因組比對 利用miRDeep2 軟件將上述未注釋Reads 與參考綿羊基因組（Oar_v3.1）進(jìn)行序列比對分析，獲取其在參考基因組上的位置信息。如表4 所示，TY_1 和XWHY_1 樣品比對到綿羊基因組的比例分別為52.14% 和51.22%，說明50% 以上的Reads 能比對到綿羊基因組上。

表4 與參考基因組比對信息統(tǒng)計(jì)表

2.4 miRNA 的鑒定 對于上述比對到參考基因組的序列，利用miRDeep2 軟件進(jìn)行已知及新發(fā)現(xiàn)miRNA的鑒定。即將18～30 nt 的核苷酸序列比對到miRBase（V21.0）數(shù)據(jù)庫中特定物種上，鑒定其已知的miRNA。對于未比對到參考基因組的序列，通過堿基數(shù)目延伸，進(jìn)行miRNA 結(jié)構(gòu)預(yù)測，獲得新發(fā)現(xiàn)miRNA（novel miRNAs）。經(jīng)過比對共檢測到561 個(gè)miRNAs，其中包括138 個(gè)已知miRNAs 和423 個(gè)新發(fā)現(xiàn)miRNAs。

2.5 miRNA 的長度分析 對2 個(gè)樣本中鑒定到的138個(gè)已知miRNA 和423 個(gè)新發(fā)現(xiàn)miRNA 進(jìn)行核苷酸長度統(tǒng)計(jì)。如圖1 所示，大部分miRNA 序列長度在20～24 nt，已知miRNA 和新發(fā)現(xiàn)miRNA 中所占比例分別為96.38%和95.98%。其中長度為22 nt 的序列所占比例最高，分別為42.75%和51.54%；其次為21 nt 和23 nt，其長度分布符合Dicer 酶切割的典型特征，說明測序結(jié)果質(zhì)量可靠，可用于后續(xù)分析。

圖1 miRNA 長度分布

2.6 miRNA 表達(dá)量分析對TY_1和XWHY_1樣本中鑒定出的miRNA 進(jìn)行表達(dá)量分析，并用TPM 算法對表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。TPM 歸一化處理公式：TPM=Readcount×1000000/Mapped Reads。其中，Readcount表示比對到某一miRNA 的reads 數(shù)目；Mapped Reads表示比對到參考基因組上的reads 數(shù)目。部分表達(dá)量較高的已知miRNA 如表5 所示。oar-let-7 家族在TY_1和XWHY_1 樣本中表達(dá)量均較高。

表5 部分高表達(dá)已知miRNA 表達(dá)量數(shù)據(jù)（前20 位）

2.7 miRNA qRT-PCR 驗(yàn)證 隨機(jī)選取4 個(gè)miRNA，通過qRT-PCR 的方法驗(yàn)證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖2 所示。通過比較qRT-PCR 與高通量測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表6），這4 個(gè)miRNA 在TY_1 和XWHY_1 中表達(dá)的變化趨勢基本一致，證明高通量測序結(jié)果的可靠性。

圖2 miRNA 的qRT-PCR 驗(yàn)證分析

表6 用于qRT-PCR 驗(yàn)證的miRNA 測序表達(dá)量數(shù)據(jù)

2.8 差異表達(dá)miRNA 分析 利用IDEG6 對上述鑒定出的miRNAs 進(jìn)行表達(dá)差異篩選，獲得TY_1 與XWHY_1樣品間差異表達(dá)的miRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2（FC）|Co且FDRg2 為71，其中FC 為差異倍數(shù)（Fold Change）；FDR 為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate）。結(jié)果在樣品TY_1 與XWHY_1 共篩選到63 個(gè)上調(diào)miRNAs 和16個(gè)下調(diào)miRNAs。進(jìn)一步對在2 個(gè)樣品中差異表達(dá)的79個(gè)miRNAs 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)43 個(gè)為已知miRNA，36 個(gè)為新發(fā)現(xiàn)miRNA。最后對43 個(gè)差異表達(dá)的已知miRNA進(jìn) 行 聚 類 分 析（ 圖3），oar-miR-127、oar-miR-379-5p、oar-miR-10a、oar-miR-411a-5p 和oar-miR-493-5p等在TY_1 和XWHY_1 樣品中表達(dá)量均較高，而oarmiR-376 家族（包括oar-miR-376b、c、d 和e）和oarmiR-3959-3p 在2 個(gè)樣品中的表達(dá)量差異較顯著（差異倍數(shù)大于4），提示其可能在不同品種綿羊皮膚毛囊發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。

2.9 差異表達(dá)miRNA 靶基因預(yù)測及富集分析 根據(jù)篩選到的差異表達(dá)miRNA 與綿羊的基因序列信息，用miRanda 和RNAhybrid 軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測。使用BLAST 軟件將預(yù)測靶基因序列與GO 和KEGG 等數(shù)據(jù)庫比對，獲得靶基因的注釋信息分別為3 886 和4 449個(gè)。最后對樣品TY_1 和XWHY_1 間差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 中通路類型分類統(tǒng)計(jì)，GO 統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其主要參與代謝過程、催化活性、細(xì)胞進(jìn)程和細(xì)胞組分等過程（圖4）；KEGG 通路的結(jié)果表明，差異表達(dá)miRNA 的4 449 個(gè)靶基因富集到113個(gè)信號(hào)通路上，其中在嘌呤代謝、內(nèi)吞作用和糖酵解/糖異生等信號(hào)通路上富集顯著性較高。

3 討 論

皮膚毛囊的生長發(fā)育受到多個(gè)信號(hào)分子及信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜的分子調(diào)控過程[13]。從miRNA 的角度簡析綿羊皮膚毛囊生長發(fā)育的機(jī)制，對于最終從分子水平上揭示綿羊皮膚毛囊形成的分子機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制具有重要作用。

有研究證實(shí)，灘羊在1 月齡時(shí)可宰取理想的羔皮，而小尾寒羊從胎內(nèi)到3 或4 月齡都可宰取理想的羔皮[14]。為探討這種差異形成的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)分析比較了TY_1 和XWHY_1 皮膚毛囊組織中的miRNA 表達(dá)差異。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去低質(zhì)量、去污染和去接頭等一系列處理，在灘羊和小尾寒羊皮膚毛囊組織樣品中分別得到16 350 847 個(gè)和17 891 155 個(gè)高質(zhì)量序列讀數(shù)。通過與miRBase 數(shù)據(jù)庫（V21.0）比對，在2 個(gè)樣品中共鑒定出561 個(gè)miRNA，其中138 個(gè)為已知miRNA，423 個(gè)為新發(fā)現(xiàn)miRNA。通過篩選TY_1 與XWHY_1 間差異表達(dá)miRNA 發(fā)現(xiàn)63 個(gè)為上調(diào)miRNAs，16 個(gè)為下調(diào)miRNAs。這些差異表達(dá)miRNA中43 個(gè)為已知miRNA，36 個(gè)為新發(fā)現(xiàn)miRNA。

圖3 差異表達(dá)的已知綿羊miRNA 聚類分析

圖4 差異表達(dá)miRNA 靶基因的基因本體（GO）富集分析

相對于妊娠45 d 的絨山羊，在妊娠55 d 和65 d 樣本中oar-let-7 和oar-miR-200 家族的miRNA 表達(dá)量都顯著上調(diào)，提示其可能是毛囊發(fā)育中關(guān)鍵的miRNA[15]。而在本研究中前20 個(gè)高表達(dá)的已知miRNA 中oar-let-7 家族有5 個(gè)，分別為oar-let-7f、oar-let-7a、oar-let-7g、oarlet-7i 和oar-let-7c；而oar-miR-200 家族有2 個(gè)，分別為oar-miR-200b 和oar-miR-200c。 另 外，oar-miR-200 家族在羊駝皮膚和毛囊發(fā)育中也可能起重要作用[16]。已有研究報(bào)道，oar-miR-30a-5p 和oar-miR-23a 等可通過調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（Silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT 1）參與羊毛卷曲生長[17]，而在本研究中也檢測到oar-miR- 30a-5p和oar-miR-23a 的高表達(dá)，提示其可能參與小尾寒羊和灘羊毛發(fā)卷曲生長。另外，本研究在灘羊和小尾寒羊皮膚中檢測到高水平表達(dá)的oar-miR-125b 在羊駝背部皮膚中表達(dá)量也較高[16]。與小尾寒羊相比，在灘羊皮膚毛囊中高水平表達(dá)的oar-miR-127 和oar-miR-379-5p，在藏綿羊皮膚毛囊中也檢測到[18]。而oar-miR-376 家族（包括oar-miR-376b、c、d 和e）和oar-miR-3959-3p在2 個(gè)樣品中的表達(dá)量差異最顯著（差異倍數(shù)大于4），提示其可能在不同品種綿羊皮膚毛囊發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。GO 統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)miRNA 的靶基因發(fā)現(xiàn)，其主要參與代謝過程、催化活性、細(xì)胞進(jìn)程和細(xì)胞組分等過程；KEGG 通路的結(jié)果表明，差異表達(dá)miRNA 的靶基因主要富集到嘌呤代謝、內(nèi)吞作用和糖酵解/糖異生等信號(hào)通路上。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用高通量測序技術(shù)在灘羊和小尾寒羊皮膚毛囊組織中篩選得到了79 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，并對其靶基因進(jìn)行預(yù)測，推測其可能參與了綿羊皮膚毛囊發(fā)育的調(diào)控，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。