尹曉靜，周靜華，王杰

（蘇州市相城區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 蘇州 215131）

中華絨螯蟹是蘇州地區(qū)的主要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。在養(yǎng)殖過程中，部分養(yǎng)殖戶塘口的中華絨螯蟹出現(xiàn)了活力下降甚至死亡的情況，造成了較大的損失。從患病蟹體內(nèi)分離到腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）并人工回感成功，該文有關(guān)腐敗希瓦氏菌及其藥物敏感性的結(jié)果有助于對(duì)中華絨螯蟹的細(xì)菌性疾病進(jìn)行預(yù)防和治療。

1 材料與方法

1.1 中華絨螯蟹

患病蟹來自相城區(qū)陽澄湖鎮(zhèn)的發(fā)病蟹塘，規(guī)格60～80 g，病蟹十肢無力，行動(dòng)遲緩，血液凝固慢或不凝。人工回感試驗(yàn)所用健康蟹購(gòu)自陽澄湖鎮(zhèn)養(yǎng)殖池塘，平均體質(zhì)量62 g/只。

1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、麥康凱瓊脂（MCKA）、RS瓊脂（RSA）（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；藥敏板（南京菲恩醫(yī)療科技有限公司）；E/NF生化鑒定板條、BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)、比濁儀（Becton,Dickinson and Company,USA）。

1.3 細(xì)菌分離

將病蟹在自來水中洗刷外殼，并用干凈紗布吸干表面水分，然后以無菌操作打開外殼，取肝臟在TSA平板上劃線分離，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，從平板上形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落中選取單個(gè)菌落，再次TSA平板劃線，直至獲得細(xì)菌純培養(yǎng)物。再取單個(gè)菌落分別劃線于MCKA平板和RSA平板，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 生化鑒定 將分離菌純培養(yǎng)物劃線MCKA平板，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h，挑取菌苔至0.85%NaCl生理鹽水中，用比濁儀配制成0.5麥?zhǔn)蠞舛染?，菌液接入E/NF生化鑒定板條，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，板條通過BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定分析。

1.4.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 分離菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增與序列分析委托蘇州泓迅生物科技有限公司完成。

1.5 人工感染

健康蟹分放在5個(gè)中轉(zhuǎn)箱（長(zhǎng)×寬×高=60 cm×40 cm×30 cm，水深 10cm）中，充氧，不投餌，室溫空調(diào)維持27～28℃，暫養(yǎng)3 d，棄去傷殘?bào)w弱，開始試驗(yàn)。設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組，每組10只蟹。采用肌肉注射法，每組注射分離菌液濃度分別為 2×108、1×108、0.5×108、0.25×108CFU/mL，每只 0.1mL。同時(shí)設(shè)一對(duì)照組，注射同等量無菌生理鹽水，48h后觀察結(jié)果并記錄蟹發(fā)病死亡情況。對(duì)剛死的蟹立即進(jìn)行細(xì)菌分離，如果重新分離到接種菌株且為優(yōu)勢(shì)菌株，即可以確定蟹發(fā)病死亡是由該菌株造成。采用改良寇氏法計(jì)算分離菌株對(duì)河蟹的LD50。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用南京菲恩醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的藥敏板對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，選用抗生素如下：恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、紅霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、鹽酸土霉素、強(qiáng)力霉素。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

從兩病蟹肝臟分離出12株優(yōu)勢(shì)菌株，取代號(hào)為SP25。TSA平板培養(yǎng)24 h后可見各優(yōu)勢(shì)菌株呈現(xiàn)出相同的菌落形態(tài)：菌落圓形，直徑1～2 mm，邊緣整齊，輕度凸起，表面濕潤(rùn)、光滑，不透明。菌落在TSA、MCK和RSA平板上均生長(zhǎng)良好，分別呈淡黃色、黃色和黑色。

2.2 細(xì)菌鑒定

2.2.1 生化分析 通過BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)的生化分析，菌株SP25鑒定為腐敗希瓦氏菌。

2.2.2 序列分析 通過對(duì)菌株SP25的16S rDNA的PCR擴(kuò)增與測(cè)序，獲得一段長(zhǎng)1 430 bp的序列（GenBank登錄號(hào)為 JN555612）。Blast比對(duì)結(jié)果顯示，菌株SP25與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢出的16株Shewanella putrefaciens菌株的相似度均大于98%。

綜合生化分析和序列分析，菌株SP25鑒定確定為腐敗希瓦氏菌。

2.3 人工感染

SP25菌株的人工回感河蟹試驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1可見，在感染SP25菌株后48 h，3.23×105CFU/g劑量組的蟹病死率達(dá)100%，0.40×105CFU/g劑量組的蟹病死率為20%，而對(duì)照組的蟹在試驗(yàn)期間無病狀和死亡。感染發(fā)病的蟹活力下降、附肢無力，不久便死亡。從剛死亡的病蟹中分離到大量與SP25菌株菌落形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌株（RSA平板培養(yǎng)菌落呈黑色，BBL Crystl微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為腐敗希瓦氏菌）。測(cè)得SP25菌株感染河蟹48 h的LD50為6.17×104CFU/g。

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥物敏感性測(cè)試結(jié)果見表2。表2可見，菌株SP25對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸環(huán)丙沙星較為敏感，對(duì)甲砜霉素耐藥。

表1 菌株SP25對(duì)河蟹的人工感染試驗(yàn)

表2 菌株SP25藥物敏感性測(cè)試mg/L

3 討論

近年，國(guó)內(nèi)外相繼發(fā)現(xiàn)有腐敗希瓦氏菌感染金帶籃子魚（Siganus rivulatus）[1]、歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax）[2]、大黃魚（Pseudosciaena crocea）[3]以及大菱鲆（Scophthalmus maximus）[4]等海水養(yǎng)殖動(dòng)物的研究報(bào)道。作為水產(chǎn)動(dòng)物的病原菌，卻較少見到腐敗希瓦氏菌感染淡水養(yǎng)殖動(dòng)物的報(bào)告，國(guó)外目前僅見 Kozi ska等[5]所發(fā)現(xiàn)的鯉魚（Cyprinus carpio）和鱒魚（Oncorhynchus mykiss）的感染病例，國(guó)內(nèi)也僅見腐敗假單胞菌感染河蟹[6]和腐敗希瓦氏菌感染異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[7]的有關(guān)研究報(bào)道。對(duì)河蟹進(jìn)行的人工回感試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的腐敗希瓦氏菌能使健康河蟹致病死亡，病蟹表現(xiàn)出與自然狀態(tài)下感染腐敗希瓦氏菌相似的臨床特征，同時(shí)從發(fā)病死亡的蟹體內(nèi)又重新分離到了該菌株，根據(jù)Koch法則，可以確定腐敗希瓦氏菌即是導(dǎo)致河蟹發(fā)病死亡的致病菌。

腐敗希瓦氏菌是冰鮮魚的主要腐敗菌[8-10]，該試驗(yàn)采集的病蟹也主要是投喂冰鮮魚餌料，因此，在河蟹養(yǎng)殖中，倡導(dǎo)養(yǎng)殖戶使用顆粒飼料替代冰鮮魚，或冰鮮魚經(jīng)消毒殺菌處理后再投喂，能有效避免腐敗希瓦氏菌的感染，減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。