丁琭，莫緩椰，鮮瑤，涂康生

（西安交通大學第一附屬醫(yī)院 1.麻醉科 2.肝膽外科 3.營養(yǎng)科，陜西 西安 710061）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見和最具侵襲性的人類惡性腫瘤之一[1]。HCC預后不良和高復發(fā)率主要是由于肝內和肝外轉移的高發(fā)率[2]。轉移是一個復雜的過程，許多細胞內在成分和外在微環(huán)境因素影響HCC細胞的轉移潛能[3]。然而，介導HCC侵襲轉移的潛在分子機制仍然很不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約22～24個核苷酸的小型非編碼RNA分子，它們通過靶向mRNA降解和翻譯抑制參與基因表達的轉錄后調控[4-5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在不同的生理和病理學過程發(fā)揮關鍵作用，如細胞增殖、分化、凋亡和細胞周期進程[6-8]。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)miR-876-5p在HCC組織中表達降低，其通過靶向抑制BCL6共抑制因子樣蛋白1（BCL-6 corepressor-like-1，BCORL1）阻斷上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和HCC細胞侵襲[9]。另外miR-1468通過激活過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ）介導的Akt信號通路促進HCC進展[10]。miR-942-5p是一個新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關miRNA，其在乳腺癌患者血清標本中表達顯著高于健康對照組[11]。miR-942-5p通過下調干擾素刺激基因12a（interferon stimulated gene 12a，ISG12a）減少腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）誘導的腫瘤細胞凋亡[12]。另外，miR-942-5p通過激活Wnt/β連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路促進食管鱗狀細胞癌中的腫瘤干細胞樣特征[13]。然而miR-942-5p在HCC中的表達和功能國內外尚未見報道。本研究檢測miR-942-5p在HCC及癌旁組織中的表達，分析miR-942-5p表達與HCC臨床病理特征及患者生存率的相關性，通過分子生物學實驗明確miR-942-5p在HCC中的功能及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2017年1月—2017年12月西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科組織樣本庫保存的手術切除HCC及對應癌旁組織（距離腫瘤邊緣≥2 cm）標本73例。收集的樣本均經(jīng)病理學確認，組織標本最初在液氮中快速冷凍，然后在-80 ℃下儲存直至使用。所有患者均簽署了書面知情同意書，本研究經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 主要材料

HCC細胞株HCCLM3和MHCC97H以及HEK293T細胞均由本實驗室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol試劑、Lipofectamine 2000、反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；0.25%胰酶-EDTA購自美國Hyclone公司；青霉素、鏈霉素溶液和二抗羊抗鼠IgG購自美國Sigma公司；miR-942-5p mimics/inhibitors、陰性對照及miR-942-5p PCR引物購自廣州銳博生物技術有限公司；All-in-One?miRNA qPCR定量檢測試劑盒和含有3'UTR FBLN5的熒光素酶報告載體購自廣州復能基因有限公司；Transwell小室及六孔板購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD Biosciences公司；RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司；PVDF膜和ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；FBLN5抗體購自美國R&D Systems公司；GAPDH抗體購自美國United States Biological公司；定點突變試劑盒購自美國Agilent Technologies公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞轉染取對數(shù)生長期的HCCLM3及MHCC97H細胞，按2×105個細胞每孔接種于六孔板中，待細胞貼壁后根據(jù)Lipofectamine 2000說明書轉染等量（50 nmol/L）的 miR-942-5p 抑制物和陰性對照序列。轉染48 h后實時定量PCR和Western blot分別檢測miR-942-5p表達和FBLN5蛋白表達。

1.3.2 實時定量PCR檢測用TRIzol試劑從組織和培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，使用反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，has-miR-942-5p引物序 列 RT：5'-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC ACA T-3'；F：5'-GCG CGC TCT TCT CTG TTT TGG C-3'，R：5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'；U6 引物序列 RT：5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'；F：5'-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3'，R：5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3'。參照 All-in-One? miRNA qPCR 定量檢測試劑盒說明書，應用美國ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統(tǒng)進行PCR反應，每個模板設3個復孔，取平均 CT值，以 2-ΔΔCT法計算 miR-942-5p的相對表達量。

1.3.3 Western blot使用RIPA緩沖液裂解來自培養(yǎng)細胞的總蛋白質，BCA法定量蛋白濃度，取等量總蛋白加入2×上樣緩沖液后100 ℃煮沸5 min。將蛋白質在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上完全電泳，并轉移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉 2 h，將膜與一抗（FBLN5，1:1 000；GAPDH，1:5 000）在4 ℃溫育過夜，然后將膜與二抗（1:1 000）室溫孵育 1～2 h，ECL 發(fā)光液顯影，應用Amersham? Imager 600凝膠成像儀拍照。

1.3.4 miR-942-5p在HCC中的生存率分析應用OncoLnc網(wǎng)站（http://www.oncolnc.org/）平臺分析TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-942-5p與HCC患者預后的相關性，OncoLnc網(wǎng)站建議對于樣本量較大的腫瘤數(shù)據(jù)，推薦比較表達前1/3和后1/3的樣本數(shù)據(jù)。因此，采用Kaplan-Meier分析miR-942-5p表達水平前33%的HCC患者（n=119）和后33%的HCC患者（n=119）的生存時間。

1.3.5 Transwell實驗使用Transwell小室測定HCC細胞的遷移和侵襲能力。針對細胞遷移測定，小室的上層和下層由具有8 μm孔的聚碳酸酯膜隔開，在小室底部加入含10%FBS的DMEM作為化學引誘劑，將5×104個轉染后HCC細胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基混懸并接種在小室上層，然后將小室在37 ℃下含有5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中孵育24 h，遷移到膜下側的細胞用0.1%結晶紫染色，顯微鏡下拍照和計數(shù)。針對細胞侵襲測定，Matrigel基質膠按1:8稀釋加入小室上室面，其余操作同上。

1.3.6 熒光素酶報告基因實驗根據(jù)定點突變試劑盒說明書突變野生型3'UTR-FBLN5中潛在的miR-942-5p結合位點，構建攜帶突變型3'UTRFBLN5的熒光素酶報告基因質粒。HEK293T細胞以3.5×104/孔的細胞密度接種在六孔板中，待融合度達到80%后，用miR-942-5p mimics或陰性對照和含有野生型3'UTR-FBLN5或突變型3'UTR-FBLN5的熒光素酶報告基因質粒（1 mg/孔）瞬時共轉染細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)說明書在轉染48 h后測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性，將熒光素酶活性標準化為海腎熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學處理

實驗結果采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學處理。組間比較采用Student's-t檢驗，使用Kaplan-Meier方法繪制總體存活曲線，并進行Logrank分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-942-5p在HCC和癌旁組織中的表達

應用實時定量PCR檢測73例HCC和癌旁組織中miR-942-5p的表達水平，結果顯示miR-942-5p在HCC組織中的表達明顯高于對應的癌旁組織[（2.390±1.495）vs.（1.764±0.987），P=0.0033]（圖1）。

圖1 miR-942-5p在HCC和癌旁組織中的表達Figure1 The expressions of miR-942-5p in HCC tissue and tumor-adjacent tissue

2.2 miR-942-5p表達與HCC患者臨床病例特征的關系

根據(jù)miR-942-5p在73例HCC組織中的中位表達水平，將HCC患者分為miR-942-5p高表達組（n=37）和低表達組（n=36），統(tǒng)計學分析miR-942-5p表達與HCC患者臨床病理特征的相關性，結果顯示，miR-942-5p在多個腫瘤（≥2）、有血管浸潤和高TNM分期（III+IV）的HCC組織中表達水平明顯高于單個腫瘤、無血管浸潤和低TNM分（I+II）期的HCC組織（P＜0.05）；而miR-942-5p表達與患者性別、年齡、HBsAg狀態(tài)、AFP水平、腫瘤大小、肝硬化和Edmondson-Steiner分級無明顯關系（均P＞0.05）（表1）。

表1 miR-942-5p表達與HCC患者臨床病理特征的關系[n（%）]Table1 Relations of miR-942-5p expression with clinicopathologic features of HCC patients[n (%)]

2.3 miR-942-5p與HCC患者總生存率的關系

在OncoLnc網(wǎng)站（http://www.oncolnc.org/）平臺基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析miR-942-5p表達與HCC患者總生存率的關系，結果顯示miR-942-5p表達水平前33%的HCC患者（n=119）的總生存時間明顯低于miR-942-5p表達后33%的HCC患者（n=119）（P=0.017 6）（圖2）。

2.4 干擾miR-942-5p表達對HCC細胞遷移和侵襲的影響

使用Lipofectamine 2000瞬時轉染miR-942-5p inhibitors或陰性對照至HCCLM3及MHCC97H細胞中，轉染48 h后實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-942-5p抑制物能明顯降低HCCLM3和MHCC97H細胞中miR-942-5p表達水平（均P＜0.05）（圖3）。應用Transwll小室檢測HCC細胞遷移和侵襲能力，結果顯示干擾miR-942-5p能明顯抑制HCCLM3和MHCC97H細胞遷移和侵襲能力（P＜0.05）（圖4-5）。

圖3 miR-942-5p抑制物在HCCLM3和MHCC97H細胞中的干擾效果Figure3 The knockdown efficiency of miR-942-5p inhibotors in HCCLM3 and MHCC97H cells

圖4 干擾miR-942-5p抑制HCCLM3和MHCC97H細胞遷移Figure4 miR-942-5p knockdown inhibited the migration of HCCLM3 and MHCC97H cells

圖5 干擾miR-942-5p抑制HCCLM3和MHCC97H細胞侵襲Figure5 miR-942-5p knockdown inhibited the invasion of HCCLM3 and MHCC97H cells

2.5 miR-942-5p下游靶點分析結果

在StarBase V3.0[14]網(wǎng)站（http://starbase.sysu.edu.cn/）平臺預測miR-942-5p潛在的下游靶點，結果發(fā)現(xiàn)miR-942-5p與FBLN5 3'UTR存在互補結合序列。在HEK293T細胞中共轉染miR-942-5p模擬物或陰性對照序列和野生型FBLN5-3'UTR或突變型FBLN5-3'UTR，結果顯示，過表達miR-942-5p明顯降低包含野生型FBLN5-3'UTR質粒的熒光素酶活性，但不影響包含突變型FBLN5-3'UTR質粒的熒光素酶活性（P＜0.05）（圖6）。應用Western blot檢測轉染miR-942-5p抑制物或陰性對照序列的HCC細胞中FBLN5蛋白表達，結果顯示干擾miR-942-5p導致HCCLM3和MHCC97H細胞中FBLN5蛋白表達明顯增加（圖7）。

圖6 miR-942-5p下游靶點預測與分析Figure6 Prediction and analysis of the downstream target of miR-942-5p

圖7 干擾miR-942-5p對HCCLM3和MHCC97H細胞中FBLN5蛋白表達的影響Figure7 Influence of miR-942-5p knockdown on expression of FBLN5 protein in HCCLM3 and MHCC97H cells

3 討 論

越來越多的研究證實miRNAs通過轉錄后調控癌基因或腫瘤抑制基因在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-18]，因此，研究致癌或腫瘤抑制性miRNAs對于揭示HCC進展的分子機制十分關鍵。本課題組前期發(fā)表了大量有關miRNA與HCC的相關研究，例如發(fā)現(xiàn)miR-194-5p被長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）MCM3AP反義RNA1（MCM3AP antisense RNA 1MCM3APAS1）競爭性結合，其通過靶向調控叉頭盒蛋白A1（forkhead box A1，F(xiàn)OXA1）抑制HCC細胞增殖并誘導凋亡[19]。另外miR-1296通過靶向阻斷絲氨酸-精氨酸蛋白特異性激酶1（serine-arginine protein kinase 1，SRPK1）介導的PI3K/AKT信號通路抑制EMT和HCC侵襲轉移[20]。近年來，越來越多的研究報道m(xù)iR-942-5p在人惡性腫瘤的中的表達和功能。研究發(fā)現(xiàn)miR-942-5p在膀胱尿路上皮癌[21]、肺腺癌[22]和乳腺癌[11]患者血清中表達均顯著高于健康對照組。miR-942-5p高表達與轉移性腎細胞癌患者的進展時間和總體存活率顯著相關[23]。miR-942-5p在結直腸癌組織中表達顯著升高，其通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進腫瘤細胞增殖和轉移[24]。同時miR-942-5p在食管鱗狀細胞癌中也是通過激活Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮促癌功能[13]。目前miR-942-5p在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究重點研究miR-942-5p在HCC組織中的表達，統(tǒng)計學分析其與臨床資料和預后的相關性，并進一步探究miR-942-5p對HCC細胞遷移和侵襲的影響及其潛在機制。

本研究首先在73例HCC和對應癌旁組織中檢測miR-942-5p的表達差異，結果發(fā)現(xiàn)miR-942-5p在HCC組織中的表達水平顯著高于對應的癌旁組織。臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)miR-942-5p在多個腫瘤（≥2）、有血管浸潤和高TNM分期（III+IV）的HCC組織中表達水平顯著高于單個腫瘤、無血管浸潤和低TNM分（I+II）期的HCC組織。而進一步基于TCGA數(shù)據(jù)繪制的生存曲線和統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)miR-942-5p高表達的HCC患者總生存率顯著低于miR-942-5p低表達患者，提示miR-942-5p是一個潛在的HCC預后分子標志物。功能試驗發(fā)現(xiàn)沉默miR-942-5p顯著抑制HCCLM3和MHCC97H細胞遷移和侵襲能力，提示miR-942-5p在HCC中發(fā)揮促癌功能。通過StarBase V3.0網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)FBLN5 3'UTR存在miR-942-5p潛在互補結合序列，熒光素酶報道基因分析提示miR-942-5p可以直接結合FBLN5 3'UTR上的互補結合序列，提示FBLN5是一個m i R-9 4 2-5 p的直接下游靶點。我們既往研究[25]證實FBLN5通過下調基質金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP-7）表達抑制HCC細胞遷移和侵襲。同時細胞實驗中也發(fā)現(xiàn)干擾miR-942-5p導致HCCLM3和MHCC97H細胞中FBLN5表達明顯升高，提示miR-942-5p可能通過靶向調控FBLN5促進HCC細胞遷移和侵襲。

綜上所述，本研究表明HCC組織中miR-942-5p異常高表達與惡性臨床特征和患者預后不良密切相關。miR-942-5p可能通過直接靶向FBLN5促進HCC細胞遷移和侵襲。miR-942-5p的異常高表達可能是HCC發(fā)生進展的重要驅動因素，更重要的是，miR-942-5p/FBLN5軸可能是抗HCC治療的潛在靶點。