李驊軒, 崔淑君, 肖朝江, 董 相, 沈 怡, 姜 北

(大理大學(xué)藥物研究所藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院,云南 大理671000)

山茶科厚皮香屬植物主要分布于中美洲、南美洲、西南太平洋各島嶼、非洲及亞洲等泛熱帶和亞熱帶地區(qū),我國(guó)有14 個(gè)種,廣泛分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū),多數(shù)種產(chǎn)于廣東、廣西及云南等省區(qū)［1］。厚皮香Ternstroemia gymnanthera(Wight et Arn.)Beddome 為多年生常綠喬木或灌木,始載于《植物名實(shí)圖考》,云“生云南山中,小樹滑葉,如山梔子,開五瓣白花……”,廣泛分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū)；據(jù)《中華本草》 記載,厚皮香的葉或全株可入藥,性苦、凉,具有清熱解毒、散瘀消腫之功效［2］。有關(guān)厚皮香的研究早在上個(gè)世紀(jì)就已開始,分離鑒定了原花青定苷以及萜類、酚酸類、苯乙醇類等化合物［3-5］；在前期開展的云南藥用植物鎮(zhèn)痛活性篩選研究工作中發(fā)現(xiàn),厚皮香提取物具有較好的鎮(zhèn)痛活性。為了全面了解厚皮香中的相關(guān)活性成分,本實(shí)驗(yàn)從該植物95%乙醇提取物乙酸乙酯部位中分離得到8 個(gè)酚類化合物,其中化合物1 ～3、5～8 均為首次從該植物中分離得到,1、3、5、7 ～8 為首次從該屬植物中分離得到,1、4、7 具有顯著的鎮(zhèn)痛活性。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Bruker Avance Ⅲ-400 型核磁共振儀(德國(guó)Bruker 公司)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；LC-20 制備型高效液相色譜儀(日本島津公司)；小鼠獨(dú)立通氣籠(蘇杭科技器材有限公司)；柱層析硅膠和GF254(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences 公司)；反相硅膠RP18(日本Fuji公司)。冰醋酸(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑責(zé)任有限公司)；無菌生理鹽水(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；阿司匹林(沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司)；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等均為工業(yè)級(jí),重蒸后使用。SPF 級(jí)昆明種(KM) 小鼠,雌雄各半,許可證號(hào)SCXK(湘) 2016-002,體質(zhì)量18～22 g。

1.2 藥材 樣品于2017 年7 月采自云南省漾濞縣秀嶺,由大理大學(xué)姜北教授鑒定為厚皮香Ternstroemia gymnanthera(Wight et Arn.)Beddome,標(biāo)本(20151008-6) 存放于大理大學(xué)藥物研究所姜北教授研究組。

2 提取與分離

厚皮香干燥地上部分(14 kg) 用95%乙醇冷浸提取8 次, 提取液合并濃縮, 得到提取物2.3 kg。將其分散于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位。

乙酸乙酯部位加入適量粗硅膠(80 ～100 目)拌樣, 經(jīng)300 ～400 目硅膠柱層析, 氯仿-甲醇(1 ∶0～0 ∶1) 溶劑系統(tǒng)梯度洗脫,劃分成7 個(gè)部分(A～G)。

B 組分經(jīng)MCI 柱脫色素、 反復(fù)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇)、 Sephadex LH-20、 制備型高效液相純化,經(jīng)重結(jié)晶處理后得化合物1 (600 mg)、2(1.0 g)、3(1.8 g)、4(148 mg)、7(7 mg)。

D 組分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜(氯仿-丙酮、氯仿-甲醇)、Sephadex LH-20、制備型高效液相純化后得化合物5(5 mg)、6(5 mg)、8(6.5 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色結(jié)晶 (丙酮)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：8.82(1H,s,7-OH),7.85(1H,d,J ＝9.5 Hz,H-4),7.20(1H,s,H-5),6.80(1H,s,H-8),6.18(1H,d,J ＝9.5 Hz,H-3),3.90(3H,s,-OCH3)；13C-NMR(100 MHz,CD3COCD3)δ：161.2(C-2),113.2(C-3),144.6(C-4),112.0(C-4a),109.8(C-5),145.9(C-6),151.7(C-7),103.6(C-8),151.0(C-8a),55.6(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］ 基本一致,故鑒定為東莨菪內(nèi)酯。

化合物2：黃色油狀物。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：7.52(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),7.43(1H,dd,J ＝8.4,2.1 Hz,H-6),7.00(1H,d,J ＝8.4 Hz,H-5),3.91(3H,s,-OCH3)；13CNMR(100 MHz,CD3COCD3)δ：186.0(-COOH),165.8(-C ＝O),125.6(C-1),116.3(C-2),146.1(C-3),153.1(C-4),116.2(C-5),125.4(C-6),52.8(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］ 基本一致,故鑒定為4-hydroxy-3-(methoxycarbonyl) benzoic acid。

化合物3：無色針晶 (甲醇)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：9.76(1H,s,-CHO),7.43(1H,d,J ＝2.0 Hz,H-2),7.36(1H,dd,J ＝8.1,2.0 Hz,H-6),7.03(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5)；13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3) δ： 192.0 (-CHO),130.5(C-1),115.1(C-2),146.3(C-3),152.5(C-4),116.0(C-5),125.8(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］ 基本一致,故鑒定為原兒茶醛。

化 合 物4： 黃 色 固 體。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：6.79(1H,d,J ＝2.0 Hz,H-2′),6.72(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5′),6.68(1H,dd,J ＝8.1,2.0 Hz,H-6′),4.64(1H,s,H-2),3.64(3H,s,1-OCH3),3.27(3H,s,2-OCH3)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：173.4(C-1),83.1(C-2),128.8(C-1′),115.4(C-2′),147.0(C-3′),146.5(C-4′), 116.2 (C-5′), 120.4 (C-6′), 52.6 (1-OCH3),57.0(2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［4］基本一致,故鑒定為methyl 2-methoxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl) acetate。

化合物5：褐色油狀物。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ：6.67(1H,d,J ＝8.0 Hz,H-5),6.65(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),6.52(1H,dd,J ＝8.0,2.1 Hz,H-6),3.66(2H,t,J ＝7.2 Hz,H-2′),2.66(2H,t,J ＝7.2 Hz,H-1′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD) δ：131.7 (C-1),116.3 (C-2),146.1(C-3),144.6(C-4),117.0(C-5),121.2(C-6),39.7(C-1′),64.6(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］ 基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯乙醇。

化合物6：褐色油狀物。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ：6.70(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),6.69(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5),6.56(1H,dd,J ＝8.1,2.1 Hz,H-6),3.65(3H,s,-OCH3),3.46(2H,s,H-1′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：126.9(C-1),116.3(C-2),146.2(C-3),145.4(C-4),117.3(C-5),121.6(C-6),41.1(C-1′),174.6(C-2′),52.4(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［10］基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯乙酸甲酯。

化合物7： 白色羽狀結(jié)晶 (甲醇)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：9.85(1H,s,-CHO),7.80(2H,d,J ＝8.7 Hz,H-2,6),7.00(2H,d,J ＝ 8.7 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (100 MHz,CD3COCD3) δ： 191.0 (-CHO), 130.4 (C-1),132.8(C-2,6),116.7(C-3,5),163.9(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 基本一致,故鑒定為對(duì)羥基苯甲醛。

化 合 物8： 白 色 固 體。1H-NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ：6.81(1H,d,J ＝2.2 Hz,H-2),6.75(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5),6.62(1H,dd,J ＝8.1, 2.2 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ：127.2(C-1),115.8(C-2),145.6(C-3),144.7(C-4),117.2(C-5),121.5(C-6),40.7,(C-1′),173.4(C-2′)。 以 上 數(shù) 據(jù) 與 文 獻(xiàn)［12］ 基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯乙酸。

4 鎮(zhèn)痛活性［13-15］

采用小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)供試品的鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行測(cè)定。小鼠實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食不禁水,隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組,每組6 只,各供試品劑量為粗提物1 000 mg/kg、單體化合物50 mg/kg,灌胃給藥(0.1 mL/10 g),模型組給予等量溶劑,陽(yáng)性對(duì)照組給予阿司匹林 (200 mg/kg)。 給藥40 min后,每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液(0.1 mL/10 g),觀察并記錄注射后15 min 內(nèi)扭體潛伏期及扭體次數(shù),按下列公式計(jì)算受試物對(duì)小鼠醋酸扭體的抑制率,以此評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果見表1。

抑制率＝ ［ (模型組扭體均數(shù)-給藥組扭體均數(shù))/模型組扭體均數(shù)］ ×100%。

由表可知,厚皮香粗提物在1 000 mg/kg 劑量時(shí)顯示出一定的鎮(zhèn)痛活性,其乙酸乙酯部位在同等劑量下鎮(zhèn)痛活性有所提高,即為有效活性部位?；衔飫┝吭?0 mg/kg 時(shí),小鼠的扭體次數(shù)較模型組明顯減少, 其中1、 4、 7 有顯著差異 (P ＜0.05),抑制率大于陽(yáng)性藥阿司匹林,呈現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛活性。結(jié)合化合物2 ～3 所表現(xiàn)出的抑制小鼠醋酸扭體作用,可知所有化合物均為厚皮香鎮(zhèn)痛活性成分。

表1 鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)抑制率n=6）Tab.1 Inhibition rates in analgesic activities testsn=6）

表1 鎮(zhèn)痛活性實(shí)驗(yàn)抑制率n=6）Tab.1 Inhibition rates in analgesic activities testsn=6）

注：與模型組比較,ΔΔP＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1) 扭體次數(shù)/次 抑制率/%模型組 — 37.33±3.39 —阿司匹林組 200 20.50±2.52ΔΔ 45.08粗提物組 1 000 27.00±4.34 27.67乙酸乙酯部位組 1 000 25.80±2.39 30.89化合物1 組 50 17.60±4.77ΔΔ 52.86化合物2 組 50 24.75±8.34 33.70化合物3 組 50 31.60±4.10 15.35化合物4 組 50 16.40±4.51ΔΔ 56.07化合物7 組 50 19.83±5.56ΔΔ 46.88

5 討論

本研究采用小鼠醋酸扭體模型,初步考察了厚皮香粗提物、乙酸乙酯部位及化合物1 ～4、7 的鎮(zhèn)痛活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有供試品均具有一定作用,部分甚至優(yōu)于陽(yáng)性藥阿司匹林,表明厚皮香鎮(zhèn)痛作用有相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。另一方面,本研究中分離得到的多種酚性成分在其他相關(guān)研究中也已被證實(shí)具有顯著的鎮(zhèn)痛消炎作用,如東莨菪內(nèi)酯(1) 是雪蓮、紫花前胡、月桂等藥用植物抗炎和鎮(zhèn)痛的主要活性物質(zhì)［16］；原兒茶醛(3) 是活血定痛合劑、活血止痛湯中主要活性成分［17-18］；3,4-二羥基苯乙醇(5) 為炎立消片和炎立消膠囊中的主要活性成分［19］；對(duì)羥基苯甲醛(7) 為天麻重要的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜成分［20］。文獻(xiàn)報(bào)道,0.6%苯酚和0.45%布比卡因混合液用于膽囊切除術(shù)后鎮(zhèn)痛時(shí),可有效減少嗎啡的用量, 顯著增加鎮(zhèn)痛效果［21］； Candido等［22］通過研究也發(fā)現(xiàn)苯酚用于治療頑固性疼痛有很好的效果,并且可以緩解阿片類受體藥物引起的副作用。此外,從鎮(zhèn)痛抗炎成分乙酰水楊酸［23］結(jié)構(gòu)上看,本研究分離得到的許多成分與其具有一定的相似性,因此具有與阿司匹林相似或更好的鎮(zhèn)痛抗炎活性亦十分合理,由此更進(jìn)一步明晰了厚皮香鎮(zhèn)痛活性與酚性成分之間可能存在的內(nèi)在聯(lián)系。

近年來有關(guān)小分子酚性成分生物活性方面的研究不斷涌現(xiàn),揭示了酚酸類化合物具有除鎮(zhèn)痛抗炎以外更多的生物活性,包括抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗病毒作用等［24-25］,如3,4-二羥基苯乙酸甲酯(6) 可抑制EV71 病毒在RD 細(xì)胞中的復(fù)制,具有抗病毒潛力［26］,因此,關(guān)于小分子酚性成分分離鑒定與活性研究十分重要。本研究豐富了厚皮香屬植物中化學(xué)成分的多樣性,為后續(xù)研究該屬植物化學(xué)成分、活性物質(zhì)、潛在藥用價(jià)值等奠定了基礎(chǔ),也為開發(fā)利用相關(guān)資源提供了參考。