邱勝衛(wèi), 王 彬, 蔡乃亮

(1.海南省三亞市人民醫(yī)院中醫(yī)科,海南 三亞572000；2.海南省三亞市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,海南 三亞572000)

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中腫瘤細胞所處的內(nèi)外環(huán)境,主要包括腫瘤細胞、腫瘤局部浸潤的免疫細胞、活性介質(zhì)、間質(zhì)細胞共同構(gòu)成的局部內(nèi)環(huán)境［1］,其中作為局部浸潤的免疫細胞中最主要的免疫細胞——腫瘤相關(guān)巨噬細胞參與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲、免疫調(diào)節(jié)、血管和淋巴管形成,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用［2-3］。在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)大量腫瘤相關(guān)巨噬細胞浸潤,而且胃癌大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期與其有關(guān)［4］；臨床數(shù)據(jù)顯示,其大量浸潤是造成乳腺癌預(yù)后不良的主要原因［5］,可通過分泌多種細胞因子及趨化因子來降低放療、化療的敏感性,促進乳腺癌侵襲、浸潤和轉(zhuǎn)移,還可促進相關(guān)血管生成［6］,目前已將其作為多種腫瘤治療靶點及潛在預(yù)后指標。

小檗堿也稱為黃連素,是從黃連中分離得到的主要有效成分,用于治療腸道細菌感染引起的腹瀉［7］,它除了具有抗炎、抗微生物等作用外,還可用于抗腫瘤,其機制大多為抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移、造成腫瘤細胞代謝功能紊亂、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等［8-9］,在多種腫瘤中影響相關(guān)巨噬細胞極化［10-12］,但其是否通過免疫調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞來最終發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展目前尚無報道。研究證實,腫瘤相關(guān)巨噬細胞和腫瘤微環(huán)境與肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)特性密切相關(guān)［13］,故本實驗通過THP-1 細胞誘導(dǎo)M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細胞,研究小檗堿對與其共培養(yǎng)肺癌A549 細胞增殖、遷移和侵襲的影響,以期為該成分在肺癌臨床治療中提供實驗依據(jù)。

1 材料

小檗堿(批號110715-200911) 購于中國食品藥品檢定研究院,含有量99%。人肺癌A549 細胞株、人急性單核細胞白血病細胞THP-1 均購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞庫。二甲基亞砜(批號S16065)、Matrigel 膠購于美國Sigma 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基(批號20150714)、胰蛋白酶(批號25200-78)、胎牛血清(批號20150618) 購于美國Gibco 公司；青霉素、鏈霉素購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司； Trizol 試劑 (批號16827454) 購于美國Invitrogen 公司；MTT 檢測試劑盒(批號140705) 購于碧云天生物技術(shù)有限公司；ELISA 檢測試劑盒(批號D710323-0048)、實驗所用引物均購于或合成于上海生工生物工程有限公司； BCA 蛋白定量試劑盒 (批號D9109B)、ECL 發(fā)光檢測試劑盒(批號IH0028) 購于大連寶生物工程有限公司； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (批號RR048A)、RT-PCR 試劑盒(批號RR421A) 購于日本TaKaRa 公司；IL-10 抗體、TGF-β 抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購于美國Novus Biologicals 公司； Transwell 小室 (孔徑8.0 μm, 直徑6.5 mm) 購于美國Corning 公司。

2 方法

2.1 細胞增殖檢測 采用MTT 法。將處于對數(shù)生長期的THP-1 細胞以5×103/孔密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,分別用0、5、10、20、50 μmol/L 小檗堿處理,每組設(shè)置3 個平行復(fù)孔,分別處理24、48、72 h 后,每孔細胞中添加5 mg/mL MTT 溶液20 μL, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,棄去上清液,再向每孔細胞中添加100 μL 二甲基亞砜,避光充分振蕩混勻,待沉淀完全溶解后, 酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處檢測光密度值(OD 值),計算細胞增殖率,公式為增殖率＝ (實驗組OD 值/對照組OD 值) ×100%。

2.2 細胞誘導(dǎo)和分組 參照文獻［14］,將處于對數(shù)生長期的THP-1 細胞以3×105/孔密度接種于6 孔板中,將細胞分為3 組：對照組細胞直接加入終濃度100 nmol/L 的PMA 處理72 h,THP-1 細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞； 模型組細胞在加入終濃度100 nmol/L PMA 處 理 6 h 后, 加 入 終 濃 度20 ng/mL IL-4 繼續(xù)誘導(dǎo)66 h,此時THP1 細胞轉(zhuǎn)化為2 型巨噬細胞； 小檗堿組先加入終濃度20 μmol/L小檗堿預(yù)處理1 h 后,再加入終濃度100 nmol/L PMA 處理6 h, 最后加入終濃度20 ng/mL IL-4 誘導(dǎo)66 h。各組細胞經(jīng)PBS 洗滌后,不同激活狀態(tài)的巨噬細胞更換1 mL 無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后,收集上清液和細胞。

2.3 CD206、IL-10、TGF-β 表達檢測 采用RTPCR 法。各組細胞以Trizol 法提取總RNA,紫外分光光度計檢測濃度和純度后,選取兩者都達到要求的RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,將其質(zhì)量濃度調(diào)整為50 ng/μL,RT-PCR 試劑盒進行檢測,實時熒光定量PCR 儀檢測目標基因。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,40 個循環(huán),最后72 ℃終延伸10 min。以β-actin 為內(nèi)標,以相對定量2-△△Ct檢測細胞中CD206、IL-10、TGF-β 表達。

2.4 IL-10、TGF-β 表達檢測 采用Western blot法。各組細胞中加入蛋白裂解液, 置冰上裂解30 min后提取蛋白,BCA 試劑盒測定蛋白濃度,取120 μg,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,半干法轉(zhuǎn)移凝膠上的蛋白至PVDF 膜上,于5%小牛血清封閉液中封閉4 h,分別加入IL-10 一抗(1 ∶1 000倍稀釋)、TGF-β(1 ∶1 000 倍稀釋) 進行雜交,搖床上4 ℃孵育過夜,TBS 洗膜后,加入二抗(1 ∶1 500 倍稀釋) 進行雜交,室溫孵育2 h。TBS洗滌后,ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進行發(fā)光,暗室中曝光拍照,Image J 圖像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值,以β-actin 為內(nèi)標蛋白,以相對灰度值表示IL-10、TGF-β 蛋白相對表達。

2.5 IL-10 水平檢測 采用ELISA 法。將各組細胞培養(yǎng)上清按照相應(yīng)ELISA 檢測試劑盒說明書進行操作,分別為一抗工作液進行孵育,洗去未結(jié)合成分；二抗工作液進行孵育,洗去未結(jié)合成分；發(fā)光工作液進行孵育,待孵育完成后需立即終止反應(yīng),酶標儀上檢測各孔OD 值,參照標準曲線檢測IL-10 水平。

2.6 共培養(yǎng)對A549 細胞增殖的影響 采用MTT法。將單核細胞THP1 誘導(dǎo)為腫瘤相關(guān)巨噬細胞后,收集各組不同激活狀態(tài)的巨噬細胞上清液,將其與A549 細胞共培養(yǎng)24、48、72 h 后,檢測對A549 細胞增殖的影響,方法同“2.1” 項。

2.7 細胞侵襲和遷移能力檢測 采用Transwell 實驗。Matrigel 膠以無血清培養(yǎng)基稀釋后,加到Transwell 小室的上室中, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min,制備Matrigel 基質(zhì)膠涂層。將各組細胞用0.25%胰蛋白酶消化,PBS 洗滌后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞制成單細胞懸液,將細胞密度調(diào)整為2×105/mL,Transwell 上室加入200 μL 細胞懸液,下室加入各組不同激活狀態(tài)的巨噬細胞上清液500 μL,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出Transwell小室,拭去上室細胞及碎片,結(jié)晶紫染色,PBS 清洗在倒置顯微鏡下觀察小室濾膜下室附著的細胞,隨機選取5 個視野,計數(shù)穿過膜的細胞數(shù),統(tǒng)計細胞侵襲能力。 同法檢測各組細胞遷移能力,Transwell 上室濾膜不經(jīng)Matrigel 基質(zhì)膠涂覆,其余步驟同Transwell 侵襲實驗。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理,數(shù)據(jù)以表示,組內(nèi)比較采用單因素方差分析,組間比較采用SNK-q 檢驗,每組數(shù)據(jù)代表3 個生物學(xué)重復(fù)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小檗堿對THP-1 細胞增殖的影響 圖1 顯示,處理48 h 后0、5、10 μmol/L 小檗堿對THP-1細胞增殖無顯著影響(P＞0.05)；濃度從20 μmol/L開始增加時,細胞增殖率逐漸降低,并隨著作用時間延長呈反比,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；濃度為50 μmol/L 時,處理THP-1 細胞24、48、72 h 后細胞增殖率均顯著下降(P ＜0.05),表明有一定毒副作用,故選擇20 μmol/進行后續(xù)實驗。

圖1 小檗堿對THP-1 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of berberine on THP-1 cell proliferation

3.2 小檗堿對THP-1 細胞轉(zhuǎn)化為M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細胞的影響 圖2 顯示,與對照組比較,模型組CD206、 IL-10、 TGF-β 表 達 顯 著 升 高 (P ＜0.05),表明腫瘤相關(guān)巨噬細胞誘導(dǎo)成功,而且誘導(dǎo)后的細胞表型為M2 型；與模型組比較,小檗堿組三者表達顯著降低(P＜0.05)。

圖2 小檗堿對THP-1 細胞轉(zhuǎn)化為M2 型腫瘤相關(guān)巨噬細胞的影響Fig.2 Effect of berberine on the conversion of THP-1 cells into M2 tumor-associated macrophages

3.3 小檗堿對A549 細胞增殖的影響 圖3 顯示,模型組上清培養(yǎng)液共培養(yǎng)的A549 細胞在24、48、72 h 的OD 值均顯著高于對照組(P＜0.05),而小檗堿組均顯著低于模型組(P＜0.05)。

圖3 小檗堿對A549 細胞增殖的影響Fig.3 Effect of berberine on A549 cell proliferation

3.4 小檗堿對A549 細胞遷移的影響 圖4 顯示,模型組上清培養(yǎng)液共培養(yǎng)的A549 細胞遷移能力顯著高于對照組(P＜0.05),而小檗堿組顯著低于模型組(P＜0.05)。

3.5 小檗堿對A549 細胞侵襲的影響 圖5 顯示,模型組上清培養(yǎng)液共培養(yǎng)的A549 細胞侵襲能力顯著高于對照組(P＜0.05),而小檗堿組顯著低于模型組(P＜0.05)。

4 討論

肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率正逐年上升,給人類健康和生命造成嚴重影響,其發(fā)病原因目前尚不十分明確,但其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移惡性生物學(xué)特性是導(dǎo)致患者死亡的主要原因,也是治療難點［15］。研究表明,腫瘤微環(huán)境與腫瘤細胞能在特定器官發(fā)生和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)［16］,它是由大量不同類型細胞構(gòu)成的局部病理環(huán)境,免疫細胞是主要組成,參與抗腫瘤免疫反應(yīng)的激活,發(fā)揮清除腫瘤細胞作用,還可被腫瘤細胞募集,促進免疫細胞的長,在腫瘤行為學(xué)特性中發(fā)揮舉足輕重的作用［17］。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞是免疫細胞的成員之一,組織類型、腫瘤類型、腫瘤分期等多項因素影響其異質(zhì)性,它具有的表型及功能與浸潤到腫瘤組織的部位相關(guān),在腫瘤發(fā)展不同階段其表型也不同,慢性炎癥階段大多呈M1 型,浸潤及血管生成階段則大多呈M2 型［18］。其中,M1 型可分泌一些促炎細胞因子、趨化因子；M2 型可分泌多種抗炎分子,如CD206、IL-10、TGF-β 等［19-20］。本實驗發(fā)現(xiàn),由單核細胞THP1 誘導(dǎo)成的腫瘤巨噬細胞CD206、IL-10、TGF-β 表達均上調(diào),表明它們具有M2 分子表型,故將其用于后續(xù)實驗。

圖4 小檗堿對A549 細胞遷移的影響Fig.4 Effect of berberine on A549 cell migration

圖5 小檗堿對A549 細胞侵襲的影響Fig.5 Effect of berberine on A549 cell invasion

小檗堿具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性,但其作用機制目前尚不清楚。體內(nèi)實驗中,小鼠灌胃小檗堿后細菌感染存活率明顯升高；體外實驗中,小檗堿處理小鼠巨噬細胞后可增強炎癥小體活化,促進成熟IL-1β 釋放及細胞凋亡,表明該成分可通過增強巨噬細胞抗菌功能來達到抗菌消炎作用；在小鼠皮下移植結(jié)腸癌CT26 細胞后用小檗堿治療移植瘤,發(fā)現(xiàn)其生長明顯受到抑制,而且CD206、CD68 陽性細胞數(shù)顯著增多,表明該成分是通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞形成來抑制腫瘤生長［21］；本實驗發(fā)現(xiàn),與模型組相比小檗堿組M2型巨噬細胞標志物CD206、IL-10、TGF-β 表達明顯降低,表明該成分可抑制巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化。另外,小檗堿可抑制脂多糖、白細胞介素-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7 細胞向M2 型極化,在維持M1/M2 動態(tài)平衡中發(fā)揮作用［22］,與本實驗結(jié)果一致；可抑制家族性腺瘤性息肉病(FAP) 動物模型Apc(Min/+) 小鼠腸道息肉的生長,其作用機制與其誘導(dǎo)息肉組織中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞分化,抑制環(huán)氧合酶-2 表達有關(guān)［23］；可抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細胞相關(guān)炎癥因子的釋放, 抑制JNK、IKKβ 信號通路激活,介導(dǎo)脂肪細胞的糖代謝功能恢復(fù)［24］；可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞轉(zhuǎn)移,抑制細胞分泌IL-8 及與腫瘤巨噬細胞共培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌細胞增殖［11］；本實驗通過不同激活狀態(tài)的腫瘤相關(guān)巨噬細胞培養(yǎng)上清與肺癌A549 細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)小檗堿可抑制A549 細胞增殖、遷移和侵襲,與以上研究一致。

綜上所述,小檗堿可通過作用于腫瘤相關(guān)巨噬細胞來抑制肺癌A549 細胞的增殖、侵襲和遷移,可能與其調(diào)控腫瘤巨噬細胞表型有關(guān),但它在體內(nèi)是否發(fā)揮同樣作用仍需進一步證實。本實驗可為肺癌治療提供理論依據(jù),也為抗腫瘤機制研究提供新方向。