孟秀杰, 劉媛媛, 胡久麗

(1.唐山職業(yè)技術學院,河北 唐山063000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科,河北 承德067000)

隨著人民生活水平提高和社會節(jié)奏加快,心腦血管疾病已成為危害人類的第一殺手,其中心絞痛是由冠狀動脈供血不足、心肌急劇暫時缺血缺氧所引起的,以發(fā)作性胸痛或胸部不適為主要表現(xiàn)的臨床綜合征。復方黨參片源于國家食品藥品監(jiān)督管理局 標 準 ［編 號 WS-11271 (ZD-1271) -2002-2012Z］［1］,是由黨參、丹參、北沙參、當歸、金果欖加工而成的中成藥復方制劑,具有活血化瘀、益氣寧心功效,主要用于心肌缺血所致心絞痛、胸悶等病癥的治療,嚴善福等［2］發(fā)現(xiàn)它對冠心病心絞痛的臨床療效顯著,在改善氣虛血瘀情況方面優(yōu)于復方丹參片,但現(xiàn)行質量標準［1］及前期報道［3-5］僅對該制劑中丹參所含的丹酚酸B、丹參酮ⅡA進行定量研究。

中成藥復方制劑成分復雜,其療效往往是多種成分共同作用的結果,單一組分難以全面評價其內在質量,而多組分評價模式已成為發(fā)展趨勢。因此,本實驗建立HPLC 法同時測定復方黨參片中君藥黨參特征成分黨參炔苷,臣藥丹參代表性成分丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA,臣藥當歸和佐藥北沙參主要成分補骨脂素、花椒毒素、佛手苷內酯、歐前胡素、藁本內酯的含有量,為該制劑質量標準提高和完善提供數據支持。

1 材料

Agilent 1100 型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；AE240 型分析天平(十萬分之一,瑞士Mettler-Toledo 公司)；KQ-400DB 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。復方黨參片3批(片芯0.32 g,批號170501、171101、180401)購于桂林紅會藥業(yè)有限公司。補骨脂素(110739-201617,含 有 量99.7%)、 丹 酚 酸 B (111562-201716,含有量94.1%)、 歐前胡素 (110826-201616,含有量99.6%) 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；黨參炔苷(136085-37-5,含有量 95.0%)、 丹 參 素 (22681-72-7, 含 有 量98.0%)、丹參酮ⅡA(568-72-9,含有量98.0%)、花椒毒素(298-81-7,含有量98.0%)、佛手苷內酯 (484-20-8, 含 有 量 98.0%)、 藁 本 內 酯(81944-09-4,含有量98.0%) 對照品均購于上海純優(yōu)生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Hypersil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈-0.1%甲酸,梯度洗脫(0 ～14.5 min,24.0%A；14.5 ～19.0 min,24.0%→30.0%A； 19.0 ～32.5 min, 30.0%→48.0%A；32.5～52.0 min,48.0%→72.0%A；52.0～60.0 min,72.0%→24.0%A)；0～19.0 min 時在269 nm 波長下檢測黨參炔苷［6-7］,19.0 ～32.5 min 時在280 nm波長下檢測丹參素、 丹酚酸B、 丹參酮ⅡA［8-9］,32.5～46.5 min 時在310 nm 波長下檢測補骨脂素、花椒毒素、 佛手苷內酯、 歐前胡素［10］,46.5 ～60.0 min 時在323 nm 波長下檢測藁本內酯［11］；體積流量0.9 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液 精密稱取各對照品適量,75%甲醇分別制成含黨參炔苷4.992 mg/mL、丹參素0.936 mg/mL、丹酚酸B 9.894 mg/mL、丹參酮ⅡA1.482 mg/mL、補骨脂素0.518 mg/mL、花椒毒素1.104 mg/mL、佛手苷內酯0.392 mg/mL、歐前胡素0.276 mg/mL、藁本內酯6.212 mg/mL 的貯備液,各精密吸取2.5 mL 置于50 mL 量瓶中,75%甲醇定容, 即得(質量濃度分別為0.249 6、0.046 8、0.494 7、0.074 1、0.025 9、0.055 2、0.019 6、0.013 8、0.310 6 mg/mL)。

2.3 供試品溶液 取片劑適量,除去糖衣后研成細粉,混勻,精密稱取約2.0 g,置于25 mL 具塞錐形瓶中, 精密加入75%甲醇20 mL, 超聲(400 W、40 kHz) 提取30 min,放冷,75%甲醇定容至刻度,搖勻,濾過,即得。

2.4 陰性樣品溶液 按照片劑質量標準項下的處方和制法,分別制備缺黨參、丹參、北沙參、當歸的陰性樣品,按“2.3” 項下方法制備,即得。

2.5 系統(tǒng)適應性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖1。由圖可知,各成分色譜峰峰形對稱,與相鄰峰分離度均大于1.5,理論塔板數按各成分計均大于3 500。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察 精密吸取“2.2” 項下貯備液適量,75%甲醇稀釋20 倍,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y) 進行回歸,結果見表1,可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.2 精密度試驗 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次,測得黨參炔苷、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、補骨脂素、花椒毒素、佛手苷內酯、歐前胡素、藁本內酯峰面積RSD 分別為0.71%、1.10%、0.56%、0.72%、1.04%、0.95%、1.12%、1.25%、0.62%,表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.3 重復性試驗 取同一批片劑6 份, 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得黨參炔苷、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、補骨脂素、花椒毒素、佛手苷內酯、歐前胡素、藁本內酯含有量RSD 分別為1.63%、1.70%、0.47%、1.69%、0.54%、1.71%、1.80%、0.85%、1.55%,表明該方法重復性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,測得黨參炔苷、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、補骨脂素、花椒毒素、佛手苷內酯、歐前胡素、藁本內酯峰面積RSD 分別為0.65%、1.09%、0.60%、0.76%、1.07%、1.01%、1.15%、1.20%、0.66%,表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 取含有量已知的片劑6 份,除去糖衣后研成細粉,混勻,精密稱取約1.0 g, 置于25 mL 具塞錐形瓶中, 精密加入0.931 mg/mL 黨參炔苷對照品溶液 4.0 mL、0.541 mg/mL 丹參素對照品溶液 1.0 mL、1.431 mg/mL 丹 酚 酸 B 對 照 品 溶 液 5.0 mL、0.962 mg/mL 丹參酮ⅡA對照品溶液1.0 mL、0.329 mg/mL 補骨脂素對照品溶液1.0 mL、0.648 mg/mL 花椒毒素對照品溶液 1.0 mL、0.216 mg/mL 佛手苷內酯對照品溶液1.0 mL、0.155 mg/mL 歐前胡素對照品溶液1.0 mL、0.877 mg/mL藁本內酯對照品溶液5.0 mL, 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算回收率。結果,黨參炔苷、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、補骨脂素、花椒毒素、佛手苷內酯、歐前胡素、藁本內酯平均加樣回收率 (RSD) 分別為98.33% (1.12%)、97.70% (0.95%)、 100.23% (0.78%)、 99.45%(1.40%)、98.49% (1.32%)、98.79% (0.84%)、97.86% (1.26%)、 96.97% (1.59%)、 99.12%(0.87%)。

2.7 樣品含有量測定 取3 批片劑,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定,計算含有量,結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果（mg/片，n=3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg/tablet，n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實驗以待測成分提取率為評價指標, 考察了提取溶劑 (甲醇［6,11］、75%甲醇［8,12］、50%甲醇、 乙醇)、 提取方式 (超聲提取、回流提取)、提取時間 (15、30、60 min) 對供試品溶液的影響,最終確定其制備方法為75%甲醇超聲提取30 min。

3.2 色譜條件選擇 本實驗以待測成分峰形、分離度、色譜峰基線平穩(wěn)狀況為評價指標,考察了流動相 (乙 腈-水［6,10］、 乙 腈-0.1%甲 酸［7,9］、 乙 腈-0.1%磷酸［4,12］) 對測定結果的影響,最終確定乙腈-0.1%甲酸作為流動相進行梯度洗脫,此時待測成分與其他雜質的分離度符合《中國藥典》 要求,而且色譜峰基線平穩(wěn),峰形對稱。

4 結論

本實驗采用HPLC 法同時測定了復方黨參片中黨參炔苷、丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、補骨脂素、花椒毒素、佛手苷內酯、歐前胡素、藁本內酯的含有量,該方法準確度高,重復性好,可用于該制劑質量標準的提高和完善。