張倩　李書啟

摘要：采用熱水浸提法和微波-超聲協(xié)同萃取法分別提取枸杞多糖，并對(duì)其提取率和抗氧化能力進(jìn)行比較。結(jié)果表明，熱水浸提法提取的最佳工藝：料液比為1 g ∶ 40 mL，提取時(shí)間為40 min，溫度為80 ℃，在此條件下，枸杞多糖的提取率為6.71%。微波-超聲協(xié)同萃取法的最佳工藝參數(shù)：提取時(shí)間為20 min，提取溫度為70 ℃，料液比為 1 g ∶ 40 mL，微波功率為300 W，超聲波功率為50 W，枸杞多糖的提取率為9.62%。2種提取方法所得多糖體外抗氧化活性的研究表明，二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除率隨多糖濃度的增加而增加，最高清除率分別為58.9%和89.2%;羥基自由基的清除率隨多糖濃度的增加而增加，最高清除率為60.1%和77.3%;超氧陰離子自由基的清除率隨多糖濃度的增加而增加，最高清除率分別為55.7% 和75.7%，說(shuō)明枸杞多糖具有良好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：枸杞多糖;微波-超聲協(xié)同萃取;條件優(yōu)化;體外抗氧化活性

中圖分類號(hào)：S132;R284.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0169-05

枸杞子為寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）的成熟果實(shí)，主要產(chǎn)于河北與寧夏。枸杞子中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，屬于藥食同源類食物[1]，其中最主要的功效成分即枸杞多糖，研究表明，枸杞多糖具有抗癌、抗脂肪肝和降血糖等作用[2-3]。枸杞多糖是從枸杞子中提取得到的一種水溶性多糖蛋白復(fù)合物，傳統(tǒng)提取方法多為水浸提法[4]。有研究表明，將樣品顆粒度降到40～60目，采用微波輔助提取法，枸杞多糖提取率相對(duì)于熱水浸提法有明顯提高[5-6]。陳亮等利用超聲輔助法提取黑枸杞中多糖，提取率達(dá)到12.91%[7]。超聲微波提取的最大優(yōu)點(diǎn)在于提取速度快、能耗小、時(shí)間短，有利于極性和熱不穩(wěn)定性組分的萃取[8]且已被廣泛地應(yīng)用在天然產(chǎn)物的有效成分提取中[9-10]。本研究通過(guò)對(duì)枸杞多糖在各種條件下的提取，篩選出最優(yōu)的條件以使枸杞多糖提取率達(dá)到最高，同時(shí)研究其清除自由基的能力以充分了解枸杞多糖的抗氧化活性，為今后枸杞多糖作為一種新型抗氧化劑在保健食品中的應(yīng)用與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

寧夏枸杞，市售;1，l-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigma化學(xué)公司產(chǎn)品;苯酚、硫酸、乙醇等，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀，上海新拓分析儀器科技有限公司;UV1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞原料預(yù)處理 將枸杞子放置于烘箱中干燥24 h，隨后將枸杞子經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成粗顆粒狀置于干燥器中備用。

1.3.2 枸杞多糖提取工藝 采用不同方法（熱水浸提法、微波-超聲協(xié)同萃取法）提取，流程如下：提取→提取液濃縮→乙醇沉淀→4 ℃靜置過(guò)夜→離心→再次乙醇沉淀→離心→冷凍干燥→枸杞粗多糖。

1.3.3 枸杞多糖熱水浸提法優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取5.0 g干燥枸杞子于250 mL錐形瓶中，分別考察料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）3個(gè)單因素對(duì)枸杞多糖提取率的影響;在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響枸杞多糖提取率的主要因素進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定超聲微波提取枸杞多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.4 枸杞多糖微波-超聲提取法優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取5.0 g干燥枸杞子，放入微波超聲儀提取專用錐形瓶（250 mL）中，在超聲波功率為50 W的條件下，分別研究料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、提取時(shí)間（10、15、20、25、30 min）和微波功率（100、200、300、400、500 W）4個(gè)單因素對(duì)枸杞多糖提取率的影響;在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定超聲微波提取枸杞多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.5 枸杞多糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[11]測(cè)定其多糖含量，再進(jìn)一步計(jì)算出枸杞多糖提取率，計(jì)算式如下：多糖提取率=粗多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%。

1.3.6 抗氧化活性

1.3.6.1 枸杞多糖對(duì)二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除作用 配制濃度為0.08 mmoL的DPPH溶液。取不同濃度枸杞多糖溶液于DPPH溶液中，室溫下靜置30 min后于517 nm處測(cè)定吸光度。以無(wú)水乙醇作為試劑空白，吸光度記作D1;以DPPH溶液為對(duì)照，吸光度記作D2。清除率=（D2-D1）÷D2×100%。

1.3.6.2 枸杞多糖清除羥自由基（·OH）能力的測(cè)定 分別在試管中加入9 mmol/L FeSO4溶液，9 mmol/L水楊 酸- 乙醇溶液以及不同枸杞多糖濃度的樣品溶液，最后加入 8.8 mmol/L H2O2，振蕩充分混合均勻，充分進(jìn)行反應(yīng)，在 510 nm下測(cè)定反應(yīng)的吸光度Dr。式中：Dc（以樣品溶劑代替樣品）為空白樣測(cè)定值;清除率=（Dc-Dr）÷Dc×100%。

1.3.6.3 枸杞多糖清除超氧陰離子自由基（ O-2 ·? ）活性的測(cè)定 取 0.05 mmol/L pH值為8.2的三羥甲基氨基甲烷（Tris）-HCl緩沖液于25 mL具塞比色管中，分別加入不同濃度的枸杞多糖樣液，放入25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，加3 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，振蕩混勻，在波長(zhǎng)325 nm處，每隔30 s測(cè)1次吸光度，并計(jì)算線性范圍內(nèi)1 min內(nèi)吸光度的增加值ΔD0。清除率=（ΔD0-ΔDi）÷ΔD0×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞中多糖含量的測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，用苯酚-硫酸法測(cè)定枸杞多糖含量的線性回歸方程為y=0.934x+0.009 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

2.2 熱水浸提法單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)枸杞多糖提取率的影響 由圖1-A可知，枸杞多糖的提取率隨著料液比的逐漸增大而提高。當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶ 40 mL時(shí)，枸杞多糖的提取率達(dá)到了最大值。隨后隨著料液比的繼續(xù)增大，提取率逐漸下降。因此選擇適宜的料液比1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL做后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2.2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 由圖1-B可知，當(dāng)提取溫度到達(dá)80 ℃時(shí)，枸杞多糖的提取率達(dá)到了最大值;之后隨著提取溫度的繼續(xù)增加，枸杞多糖的提取率逐漸下降。原因可能是由于多糖是活性物質(zhì)，溫度過(guò)高會(huì)破壞其生物結(jié)構(gòu);其次，由于枸杞細(xì)胞中其他雜質(zhì)的溶出也相應(yīng)增加，使多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，即多糖提取率下降。因此，提取溫度選擇70、80、90 ℃ 做后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取率的影響 由圖1-C可知，枸杞多糖提取率隨提取時(shí)間的增加而提高，當(dāng)延長(zhǎng)至 40 min 時(shí)，提取率達(dá)到最大值，隨后提取率下降?？赡苡捎谔崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致多糖發(fā)生部分破壞和降解，同時(shí)其他水溶性物質(zhì)的溶出也會(huì)降低多糖提取率。因此，時(shí)間為40 min時(shí)，枸杞多糖的提取率較適宜，選擇30、40、50 min做后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.3 熱水浸提法的正交優(yōu)化結(jié)果

選擇提取溫度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為試驗(yàn)因素，各因素均取3個(gè)水平，詳見(jiàn)表1。

由表2可以看出，正交試驗(yàn)以提取時(shí)間、提取溫度和料液比為因素，影響最大的1個(gè)因素是提取時(shí)間，最佳參數(shù)為 40 min，其他影響較大的因素是料液比，溫度對(duì)提取率的影響最小。由此可得，最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B2C2，即料液比為 1 g ∶ 40 mL，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為40 min。

由表3的分析結(jié)果可知，提取溫度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）對(duì)枸杞多糖提取率的影響均是顯著的。最優(yōu)工藝下枸杞多糖的平均提取率為6.71%，優(yōu)于正交試驗(yàn)各條件所得提取率。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)， 進(jìn)一步確定了正交試驗(yàn)所得最優(yōu)條件組合的準(zhǔn)確性。

2.4 微波-超聲協(xié)同萃取法的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響 由圖2-A可知，當(dāng)料液比為1 g ∶ 30 mL時(shí)，提取率達(dá)到最高值，并隨料液比增加，提取率下降。這可能是由于溶劑用量影響多糖浸出溶液的濃度差，從而改變?cè)蟽?nèi)部與外部之間多糖的傳質(zhì)過(guò)程。當(dāng)液料比較小時(shí)，多糖的溶出在短時(shí)間內(nèi)就達(dá)到平衡，不利于多糖的進(jìn)一步溶出，但液料比太大時(shí)受溶解度的約束作用變小，且溶劑用量過(guò)多導(dǎo)致后續(xù)蒸發(fā)困難，而底物濃度過(guò)低使得提取得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[12]。因此料液比為1 g ∶ 30 mL時(shí)，提取效果最好，故選擇料液比1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL做后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.4.2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 由圖2-B可知，隨著溫度不斷升高，枸杞多糖溶出率不斷提高，當(dāng)溫度達(dá)到 70 ℃ 時(shí)，枸杞多糖提取率達(dá)到峰值，隨后枸杞多糖提取率隨溫度的增大而降低，可能由于微波溫度過(guò)高破壞了枸杞多糖的生物活性，從而使得枸杞多糖提取率下降[13]，故選擇60、70、80 ℃做后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.4.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 由圖2-C可知，隨著提取時(shí)間增加，枸杞多糖提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)提取率達(dá)到最大值7.41%，隨后枸杞多糖提取率趨于平緩。原因可能是初期多糖在溶劑中的濃度低，主要成分在枸杞組織中，多糖濃度梯度大，導(dǎo)致多糖溶出的速率較快;隨著時(shí)間增加，多糖濃度梯度持續(xù)減小，從而使得溶出率減緩至不再增加，故選擇提取時(shí)間15、20、25 min做后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.4.4 微波功率對(duì)多糖提取率的影響 由圖2-D可知，隨著微波功率不斷升高，枸杞多糖提取率不斷提高，當(dāng)微波功率達(dá)到300 W時(shí)，提取率最高;隨后枸杞多糖提取率隨之下降，可能是由于微波功率過(guò)大導(dǎo)致枸杞多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或部分發(fā)生降解，故選擇微波功率200、300、400 W進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.5 微波-超聲協(xié)同萃取法正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果做4因素3水平正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表4。

由表5可以看出， 正交試驗(yàn)以提取時(shí)間、提取溫度、微波功率、料液比為因素，影響最大的1個(gè)因素是微波功率，微波功率的最佳參數(shù)為300 W，其他影響較大的因素是料液比，溫度對(duì)提取率的影響不是很大，影響最小的是時(shí)間，由此可得，最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B2C3D2，即微波功率為300 W，料液比為 1 g ∶ 40 mL，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為20 min。

在方差分析中，因各試驗(yàn)條件無(wú)重復(fù)，故以最小平方和作為誤差列，在α=0.05的情況下，進(jìn)行F檢驗(yàn)。

由表6可知，微波功率對(duì)枸杞多糖提取率的影響具有顯著性，表明枸杞多糖的提取率主要取決于微波功率的大小。最優(yōu)工藝下枸杞多糖的平均提取率為9.62%，優(yōu)于正交試驗(yàn)各條件所得提取率。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)一步確定了正交試驗(yàn)所得最優(yōu)條件組合的準(zhǔn)確性。

2.6 枸杞多糖抗氧化活性的測(cè)定

2.6.1 枸杞多糖對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定 DPPH·是一種合成的含氮有機(jī)自由基，其結(jié)構(gòu)中存在單電子，在乙醇溶液中呈深紫色，在波長(zhǎng)517 nm處有特征吸收峰;當(dāng)加入抗氧化劑后使DPPH·的特征紫色變成黃色，通過(guò)測(cè)定吸收減弱的程度來(lái)評(píng)價(jià)清除其自由基能力的強(qiáng)弱[14]。由圖3可知，2種提取方法得到的枸杞多糖對(duì)DPPH·均有一定的清除能力。隨著枸杞多糖濃度的增大，其DPPH·清除率也隨之提高，當(dāng)枸杞多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí)，熱水浸提法得到的枸杞多糖清除率為58.9%，而微波-超聲協(xié)同萃取法得到的枸杞多糖清除率達(dá)89.2%，由此可見(jiàn)，協(xié)同萃取所得枸杞多糖清除DPPH·的效果優(yōu)于傳統(tǒng)水提法所得枸杞多糖的清除效果。

2.6.2 枸杞多糖對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定 H2O2與FeSO4反應(yīng)（Fenton反應(yīng)）會(huì)產(chǎn)生·OH，·OH具有很強(qiáng)的氧化能力，通過(guò)攻擊水楊酸分子中的苯環(huán)使其發(fā)生氧化反應(yīng)，生成的有色物質(zhì)在波長(zhǎng)510 nm處的吸光度與·OH的生成量成正比[15]。由圖4可以得出，2種提取方法提取的枸杞多糖對(duì)羥自由基均有一定的清除能力。隨著枸杞多糖濃度的增大，其羥基自由基清除率逐漸提高，當(dāng)枸杞多糖濃度為 1.0 mg/mL 時(shí)，熱水浸提法得到的枸杞多糖清除率為 60.1%，而微波-超聲協(xié)同萃取法得到的枸杞多糖清除率為77.3%。

2.6.3 枸杞多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定? O-2 ·? 在體內(nèi)很容易產(chǎn)生，而抗氧化劑能清除 O-2 ·? ，使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在波長(zhǎng)325 nm處的吸收峰受到抑制，通過(guò)檢測(cè)中間產(chǎn)物的生成量，可測(cè)定抗氧化劑對(duì) O-2 ·? 的清除能力[16]。由圖5可得，枸杞多糖對(duì)超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除能力，隨著枸杞多糖濃度的增加，對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用增強(qiáng)，當(dāng)枸杞多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí)，熱水浸提法得到的枸杞多糖清除率為55.7%，而微波-超聲協(xié)同萃取法得到的枸杞多糖清除率為75.7%。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)過(guò)熱水浸提法提取枸杞多糖得到的最優(yōu)提取工藝為料液比1 g ∶ 40 mL，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間40 min，提取率為6.71%;利用微波-超聲協(xié)同萃取法提取枸杞多糖的最佳提取工藝為在超聲波功率為50 W的條件下，料液比為1 g ∶ 40 mL，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為20 min，微波功率

為300 W，得到枸杞多糖的提取率為9.62%。枸杞多糖的體外抗氧化活性研究表示，2種方法得到的枸杞多糖對(duì) DPPH·、·OH和超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，且微波-超聲協(xié)同萃取法的枸杞多糖清除能力強(qiáng)于熱水浸提法，說(shuō)明枸杞多糖有良好的抗氧化活性。由試驗(yàn)結(jié)果可知，微波-超聲協(xié)同萃取法所得枸杞多糖提取率較熱水浸提法明顯提高。這是由于在一定微波功率的作用下，枸杞細(xì)胞破碎得更加充分，將更多的多糖從枸杞原料中溶出，且萃取儀產(chǎn)生的電磁波加速了分子的運(yùn)動(dòng)，也可以在較短時(shí)間內(nèi)溶出較多枸杞多糖[17];其次，利用超聲波的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用使枸杞子細(xì)胞壁及整個(gè)生物體的破裂在較短時(shí)間內(nèi)即可完成，從而也能明顯提高枸杞多糖的提取效率。因此，與熱水浸提法相比，微波-超聲協(xié)同萃取法能有效節(jié)省提取時(shí)間、降低能耗并最終起到有效提高枸杞多糖提取率的作用。但在試驗(yàn)過(guò)程中，微波功率不能過(guò)高，否則也會(huì)造成多糖的部分降解[18]。

目前，大量研究表明，人體內(nèi)的衰老、慢性疾病及癌癥均與自由基有密切關(guān)系，由于自由基參與的氧化反應(yīng)損傷核酸、碳水化合物、脂類及蛋白質(zhì)，從而對(duì)人體器官和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響[19]。本試驗(yàn)中，通過(guò)2種方法得到的枸杞多糖對(duì)3種自由基均有一定清除作用，其中微波-超聲萃取法的枸杞多糖清除能力明顯強(qiáng)于熱水浸提法所得多糖。由于多糖的生物活性與其一級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系[20]，且有研究顯示，高分子質(zhì)量的殼聚糖結(jié)構(gòu)致密，從而能引起羥基和氨基活性的分子內(nèi)氫鍵的作用變?nèi)?而低分子質(zhì)量的殼聚糖結(jié)構(gòu)松散，對(duì)分子內(nèi)氫鍵的影響就相對(duì)溫和[21]。因此推測(cè)本試驗(yàn)中，微波-超聲處理使枸杞多糖分子量發(fā)生改變，將高分子質(zhì)量的多糖變?yōu)榉肿淤|(zhì)量低一些的大小適宜的碎片，使其對(duì)氫鍵的影響減小，從而表現(xiàn)出更顯著的抗氧化活性;或在處理過(guò)程中枸杞多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生部分改變，從而使得與活性作用有關(guān)的位點(diǎn)暴露出來(lái)，同樣也提高了其抗氧化活性，這為枸杞多糖的深加工和進(jìn)一步的開發(fā)提供了參考;同時(shí)微波-超聲協(xié)同萃取可以有效提高枸杞多糖的生物活性作用，更有助于多糖生物活性的研究，因此具有開發(fā)和利用價(jià)值，并且其體內(nèi)抗氧化活性機(jī)制以及多糖的構(gòu)效關(guān)系仍是今后研究的重點(diǎn)。

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