張倩　李書啟

摘要：采用熱水浸提法和微波-超聲協(xié)同萃取法分別提取枸杞多糖，并對其提取率和抗氧化能力進行比較。結(jié)果表明，熱水浸提法提取的最佳工藝：料液比為1 g ∶ 40 mL，提取時間為40 min，溫度為80 ℃，在此條件下，枸杞多糖的提取率為6.71%。微波-超聲協(xié)同萃取法的最佳工藝參數(shù)：提取時間為20 min，提取溫度為70 ℃，料液比為 1 g ∶ 40 mL，微波功率為300 W，超聲波功率為50 W，枸杞多糖的提取率為9.62%。2種提取方法所得多糖體外抗氧化活性的研究表明，二苯代苦味?；杂苫―PPH·）的清除率隨多糖濃度的增加而增加，最高清除率分別為58.9%和89.2%;羥基自由基的清除率隨多糖濃度的增加而增加，最高清除率為60.1%和77.3%;超氧陰離子自由基的清除率隨多糖濃度的增加而增加，最高清除率分別為55.7% 和75.7%，說明枸杞多糖具有良好的抗氧化活性。

關鍵詞：枸杞多糖;微波-超聲協(xié)同萃取;條件優(yōu)化;體外抗氧化活性

中圖分類號：S132;R284.2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0169-05

枸杞子為寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）的成熟果實，主要產(chǎn)于河北與寧夏。枸杞子中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，屬于藥食同源類食物[1]，其中最主要的功效成分即枸杞多糖，研究表明，枸杞多糖具有抗癌、抗脂肪肝和降血糖等作用[2-3]。枸杞多糖是從枸杞子中提取得到的一種水溶性多糖蛋白復合物，傳統(tǒng)提取方法多為水浸提法[4]。有研究表明，將樣品顆粒度降到40～60目，采用微波輔助提取法，枸杞多糖提取率相對于熱水浸提法有明顯提高[5-6]。陳亮等利用超聲輔助法提取黑枸杞中多糖，提取率達到12.91%[7]。超聲微波提取的最大優(yōu)點在于提取速度快、能耗小、時間短，有利于極性和熱不穩(wěn)定性組分的萃取[8]且已被廣泛地應用在天然產(chǎn)物的有效成分提取中[9-10]。本研究通過對枸杞多糖在各種條件下的提取，篩選出最優(yōu)的條件以使枸杞多糖提取率達到最高，同時研究其清除自由基的能力以充分了解枸杞多糖的抗氧化活性，為今后枸杞多糖作為一種新型抗氧化劑在保健食品中的應用與開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

寧夏枸杞，市售;1，l-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigma化學公司產(chǎn)品;苯酚、硫酸、乙醇等，北京化學試劑公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀，上海新拓分析儀器科技有限公司;UV1000紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞原料預處理 將枸杞子放置于烘箱中干燥24 h，隨后將枸杞子經(jīng)粉碎機粉碎成粗顆粒狀置于干燥器中備用。

1.3.2 枸杞多糖提取工藝 采用不同方法（熱水浸提法、微波-超聲協(xié)同萃取法）提取，流程如下：提取→提取液濃縮→乙醇沉淀→4 ℃靜置過夜→離心→再次乙醇沉淀→離心→冷凍干燥→枸杞粗多糖。

1.3.3 枸杞多糖熱水浸提法優(yōu)化 準確稱取5.0 g干燥枸杞子于250 mL錐形瓶中，分別考察料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、提取時間（20、30、40、50、60 min）3個單因素對枸杞多糖提取率的影響;在單因素試驗的基礎上，對影響枸杞多糖提取率的主要因素進行3因素3水平正交試驗設計，確定超聲微波提取枸杞多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.4 枸杞多糖微波-超聲提取法優(yōu)化 準確稱取5.0 g干燥枸杞子，放入微波超聲儀提取專用錐形瓶（250 mL）中，在超聲波功率為50 W的條件下，分別研究料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL）、提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、提取時間（10、15、20、25、30 min）和微波功率（100、200、300、400、500 W）4個單因素對枸杞多糖提取率的影響;在單因素試驗的基礎上，進行4因素3水平正交試驗設計，確定超聲微波提取枸杞多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

1.3.5 枸杞多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[11]測定其多糖含量，再進一步計算出枸杞多糖提取率，計算式如下：多糖提取率=粗多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%。

1.3.6 抗氧化活性

1.3.6.1 枸杞多糖對二苯代苦味?；杂苫―PPH·）的清除作用 配制濃度為0.08 mmoL的DPPH溶液。取不同濃度枸杞多糖溶液于DPPH溶液中，室溫下靜置30 min后于517 nm處測定吸光度。以無水乙醇作為試劑空白，吸光度記作D1;以DPPH溶液為對照，吸光度記作D2。清除率=（D2-D1）÷D2×100%。

1.3.6.2 枸杞多糖清除羥自由基（·OH）能力的測定 分別在試管中加入9 mmol/L FeSO4溶液，9 mmol/L水楊 酸- 乙醇溶液以及不同枸杞多糖濃度的樣品溶液，最后加入 8.8 mmol/L H2O2，振蕩充分混合均勻，充分進行反應，在 510 nm下測定反應的吸光度Dr。式中：Dc（以樣品溶劑代替樣品）為空白樣測定值;清除率=（Dc-Dr）÷Dc×100%。

1.3.6.3 枸杞多糖清除超氧陰離子自由基（ O-2 ·? ）活性的測定 取 0.05 mmol/L pH值為8.2的三羥甲基氨基甲烷（Tris）-HCl緩沖液于25 mL具塞比色管中，分別加入不同濃度的枸杞多糖樣液，放入25 ℃水浴中預熱20 min，加3 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，振蕩混勻，在波長325 nm處，每隔30 s測1次吸光度，并計算線性范圍內(nèi)1 min內(nèi)吸光度的增加值ΔD0。清除率=（ΔD0-ΔDi）÷ΔD0×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞中多糖含量的測定

以葡萄糖為標準，用苯酚-硫酸法測定枸杞多糖含量的線性回歸方程為y=0.934x+0.009 7，相關系數(shù)r=0.999 7。

2.2 熱水浸提法單因素試驗結(jié)果

2.2.1 料液比對枸杞多糖提取率的影響 由圖1-A可知，枸杞多糖的提取率隨著料液比的逐漸增大而提高。當料液比達到1 g ∶ 40 mL時，枸杞多糖的提取率達到了最大值。隨后隨著料液比的繼續(xù)增大，提取率逐漸下降。因此選擇適宜的料液比1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL做后續(xù)正交試驗。

2.2.2 提取溫度對多糖提取率的影響 由圖1-B可知，當提取溫度到達80 ℃時，枸杞多糖的提取率達到了最大值;之后隨著提取溫度的繼續(xù)增加，枸杞多糖的提取率逐漸下降。原因可能是由于多糖是活性物質(zhì)，溫度過高會破壞其生物結(jié)構(gòu);其次，由于枸杞細胞中其他雜質(zhì)的溶出也相應增加，使多糖質(zhì)量分數(shù)下降，即多糖提取率下降。因此，提取溫度選擇70、80、90 ℃ 做后續(xù)正交試驗。

2.2.3 提取時間對枸杞多糖提取率的影響 由圖1-C可知，枸杞多糖提取率隨提取時間的增加而提高，當延長至 40 min 時，提取率達到最大值，隨后提取率下降?？赡苡捎谔崛r間過長導致多糖發(fā)生部分破壞和降解，同時其他水溶性物質(zhì)的溶出也會降低多糖提取率。因此，時間為40 min時，枸杞多糖的提取率較適宜，選擇30、40、50 min做后續(xù)正交試驗。

2.3 熱水浸提法的正交優(yōu)化結(jié)果

選擇提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為試驗因素，各因素均取3個水平，詳見表1。

由表2可以看出，正交試驗以提取時間、提取溫度和料液比為因素，影響最大的1個因素是提取時間，最佳參數(shù)為 40 min，其他影響較大的因素是料液比，溫度對提取率的影響最小。由此可得，最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B2C2，即料液比為 1 g ∶ 40 mL，提取溫度為80 ℃，提取時間為40 min。

由表3的分析結(jié)果可知，提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）對枸杞多糖提取率的影響均是顯著的。最優(yōu)工藝下枸杞多糖的平均提取率為6.71%，優(yōu)于正交試驗各條件所得提取率。通過驗證試驗， 進一步確定了正交試驗所得最優(yōu)條件組合的準確性。

2.4 微波-超聲協(xié)同萃取法的單因素試驗結(jié)果

2.4.1 料液比對多糖提取率的影響 由圖2-A可知，當料液比為1 g ∶ 30 mL時，提取率達到最高值，并隨料液比增加，提取率下降。這可能是由于溶劑用量影響多糖浸出溶液的濃度差，從而改變原料內(nèi)部與外部之間多糖的傳質(zhì)過程。當液料比較小時，多糖的溶出在短時間內(nèi)就達到平衡，不利于多糖的進一步溶出，但液料比太大時受溶解度的約束作用變小，且溶劑用量過多導致后續(xù)蒸發(fā)困難，而底物濃度過低使得提取得率呈現(xiàn)下降趨勢[12]。因此料液比為1 g ∶ 30 mL時，提取效果最好，故選擇料液比1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL做后續(xù)正交試驗。

2.4.2 提取溫度對多糖提取率的影響 由圖2-B可知，隨著溫度不斷升高，枸杞多糖溶出率不斷提高，當溫度達到 70 ℃ 時，枸杞多糖提取率達到峰值，隨后枸杞多糖提取率隨溫度的增大而降低，可能由于微波溫度過高破壞了枸杞多糖的生物活性，從而使得枸杞多糖提取率下降[13]，故選擇60、70、80 ℃做后續(xù)正交試驗。

2.4.3 提取時間對多糖提取率的影響 由圖2-C可知，隨著提取時間增加，枸杞多糖提取率呈上升趨勢，當提取時間為20 min時提取率達到最大值7.41%，隨后枸杞多糖提取率趨于平緩。原因可能是初期多糖在溶劑中的濃度低，主要成分在枸杞組織中，多糖濃度梯度大，導致多糖溶出的速率較快;隨著時間增加，多糖濃度梯度持續(xù)減小，從而使得溶出率減緩至不再增加，故選擇提取時間15、20、25 min做后續(xù)正交試驗。

2.4.4 微波功率對多糖提取率的影響 由圖2-D可知，隨著微波功率不斷升高，枸杞多糖提取率不斷提高，當微波功率達到300 W時，提取率最高;隨后枸杞多糖提取率隨之下降，可能是由于微波功率過大導致枸杞多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或部分發(fā)生降解，故選擇微波功率200、300、400 W進行后續(xù)正交試驗。

2.5 微波-超聲協(xié)同萃取法正交優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果做4因素3水平正交試驗，因素水平見表4。

由表5可以看出， 正交試驗以提取時間、提取溫度、微波功率、料液比為因素，影響最大的1個因素是微波功率，微波功率的最佳參數(shù)為300 W，其他影響較大的因素是料液比，溫度對提取率的影響不是很大，影響最小的是時間，由此可得，最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B2C3D2，即微波功率為300 W，料液比為 1 g ∶ 40 mL，提取溫度為70 ℃，提取時間為20 min。

在方差分析中，因各試驗條件無重復，故以最小平方和作為誤差列，在α=0.05的情況下，進行F檢驗。

由表6可知，微波功率對枸杞多糖提取率的影響具有顯著性，表明枸杞多糖的提取率主要取決于微波功率的大小。最優(yōu)工藝下枸杞多糖的平均提取率為9.62%，優(yōu)于正交試驗各條件所得提取率。通過驗證試驗，進一步確定了正交試驗所得最優(yōu)條件組合的準確性。

2.6 枸杞多糖抗氧化活性的測定

2.6.1 枸杞多糖對DPPH·清除能力的測定 DPPH·是一種合成的含氮有機自由基，其結(jié)構(gòu)中存在單電子，在乙醇溶液中呈深紫色，在波長517 nm處有特征吸收峰;當加入抗氧化劑后使DPPH·的特征紫色變成黃色，通過測定吸收減弱的程度來評價清除其自由基能力的強弱[14]。由圖3可知，2種提取方法得到的枸杞多糖對DPPH·均有一定的清除能力。隨著枸杞多糖濃度的增大，其DPPH·清除率也隨之提高，當枸杞多糖濃度為1.0 mg/mL時，熱水浸提法得到的枸杞多糖清除率為58.9%，而微波-超聲協(xié)同萃取法得到的枸杞多糖清除率達89.2%，由此可見，協(xié)同萃取所得枸杞多糖清除DPPH·的效果優(yōu)于傳統(tǒng)水提法所得枸杞多糖的清除效果。

2.6.2 枸杞多糖對羥基自由基清除能力的測定 H2O2與FeSO4反應（Fenton反應）會產(chǎn)生·OH，·OH具有很強的氧化能力，通過攻擊水楊酸分子中的苯環(huán)使其發(fā)生氧化反應，生成的有色物質(zhì)在波長510 nm處的吸光度與·OH的生成量成正比[15]。由圖4可以得出，2種提取方法提取的枸杞多糖對羥自由基均有一定的清除能力。隨著枸杞多糖濃度的增大，其羥基自由基清除率逐漸提高，當枸杞多糖濃度為 1.0 mg/mL 時，熱水浸提法得到的枸杞多糖清除率為 60.1%，而微波-超聲協(xié)同萃取法得到的枸杞多糖清除率為77.3%。

2.6.3 枸杞多糖對超氧陰離子自由基清除能力的測定? O-2 ·? 在體內(nèi)很容易產(chǎn)生，而抗氧化劑能清除 O-2 ·? ，使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在波長325 nm處的吸收峰受到抑制，通過檢測中間產(chǎn)物的生成量，可測定抗氧化劑對 O-2 ·? 的清除能力[16]。由圖5可得，枸杞多糖對超氧陰離子自由基有較強的清除能力，隨著枸杞多糖濃度的增加，對超氧陰離子自由基的清除作用增強，當枸杞多糖濃度為1.0 mg/mL時，熱水浸提法得到的枸杞多糖清除率為55.7%，而微波-超聲協(xié)同萃取法得到的枸杞多糖清除率為75.7%。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)過熱水浸提法提取枸杞多糖得到的最優(yōu)提取工藝為料液比1 g ∶ 40 mL，提取溫度80 ℃，提取時間40 min，提取率為6.71%;利用微波-超聲協(xié)同萃取法提取枸杞多糖的最佳提取工藝為在超聲波功率為50 W的條件下，料液比為1 g ∶ 40 mL，提取溫度為70 ℃，提取時間為20 min，微波功率

為300 W，得到枸杞多糖的提取率為9.62%。枸杞多糖的體外抗氧化活性研究表示，2種方法得到的枸杞多糖對 DPPH·、·OH和超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，且微波-超聲協(xié)同萃取法的枸杞多糖清除能力強于熱水浸提法，說明枸杞多糖有良好的抗氧化活性。由試驗結(jié)果可知，微波-超聲協(xié)同萃取法所得枸杞多糖提取率較熱水浸提法明顯提高。這是由于在一定微波功率的作用下，枸杞細胞破碎得更加充分，將更多的多糖從枸杞原料中溶出，且萃取儀產(chǎn)生的電磁波加速了分子的運動，也可以在較短時間內(nèi)溶出較多枸杞多糖[17];其次，利用超聲波的空化效應、熱效應和機械作用使枸杞子細胞壁及整個生物體的破裂在較短時間內(nèi)即可完成，從而也能明顯提高枸杞多糖的提取效率。因此，與熱水浸提法相比，微波-超聲協(xié)同萃取法能有效節(jié)省提取時間、降低能耗并最終起到有效提高枸杞多糖提取率的作用。但在試驗過程中，微波功率不能過高，否則也會造成多糖的部分降解[18]。

目前，大量研究表明，人體內(nèi)的衰老、慢性疾病及癌癥均與自由基有密切關系，由于自由基參與的氧化反應損傷核酸、碳水化合物、脂類及蛋白質(zhì)，從而對人體器官和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響[19]。本試驗中，通過2種方法得到的枸杞多糖對3種自由基均有一定清除作用，其中微波-超聲萃取法的枸杞多糖清除能力明顯強于熱水浸提法所得多糖。由于多糖的生物活性與其一級結(jié)構(gòu)及高級結(jié)構(gòu)有密切關系[20]，且有研究顯示，高分子質(zhì)量的殼聚糖結(jié)構(gòu)致密，從而能引起羥基和氨基活性的分子內(nèi)氫鍵的作用變?nèi)?而低分子質(zhì)量的殼聚糖結(jié)構(gòu)松散，對分子內(nèi)氫鍵的影響就相對溫和[21]。因此推測本試驗中，微波-超聲處理使枸杞多糖分子量發(fā)生改變，將高分子質(zhì)量的多糖變?yōu)榉肿淤|(zhì)量低一些的大小適宜的碎片，使其對氫鍵的影響減小，從而表現(xiàn)出更顯著的抗氧化活性;或在處理過程中枸杞多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生部分改變，從而使得與活性作用有關的位點暴露出來，同樣也提高了其抗氧化活性，這為枸杞多糖的深加工和進一步的開發(fā)提供了參考;同時微波-超聲協(xié)同萃取可以有效提高枸杞多糖的生物活性作用，更有助于多糖生物活性的研究，因此具有開發(fā)和利用價值，并且其體內(nèi)抗氧化活性機制以及多糖的構(gòu)效關系仍是今后研究的重點。

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