史東杰　朱華　張欣　王文峰　孫硯勝

摘要：以初始體質(zhì)量約為（132.4±4.6） g的錦鯉為對象，研究不同氨氮濃度對錦鯉肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性與抗氧化酶基因（AchE、Cyp450）、皮膚體色基因（Tyr、Mc1r）表達的影響。結(jié)果表明，氨氮對錦鯉在24、48、72、96 h的半致死濃度（LC50）分別為51.34、42.53、31.18、27.29 mg/L，安全濃度為2.73 mg/L。氨氮暴露初期（2 d），各試驗組總SOD活性無顯著差異，暴露中后期（6、10、14 d），各試驗組總SOD活性整體上表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢;在氨氮脅迫下，各試驗組CAT、AChE活性分別大致呈現(xiàn)先增加后降低、一直降低的趨勢;錦鯉肝臟組織中AchE基因表達量與對照相比顯著下降（P<0.05）;Cyp450基因在暴露初期（2 d）和中期（6 d）無明顯變化，而在暴露中后期（10、14 d）表達量明顯下調(diào)（P<0.05）;皮膚體色基因Tyr、Mc1r的表達量在氨氮暴露后均明顯受到抑制?？梢缘贸?，隨著氨氮暴露濃度的增加和暴露時間的延長，錦鯉免疫酶活性和基因表達量均趨于降低，說明魚體免疫防御系統(tǒng)遭到了損傷。

關(guān)鍵詞：氨氮;錦鯉;急性毒性;基因

中圖分類號： S917? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0150-04

氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖中水質(zhì)檢測的重要指標之一，氨氮含量對水生動物的生長有很大的影響。尤其是現(xiàn)代水資源緊缺，集約化養(yǎng)殖積累了大量排泄廢物、殘余餌料，還有水生動物尸體，這些物質(zhì)經(jīng)過異養(yǎng)型細菌分解為蛋白質(zhì)和核酸，從而產(chǎn)生大量含氮有害物質(zhì)[1-2]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，氮以分子態(tài)氮（N2）、無機態(tài)氮（NH3、NH4+）及有機物等形式存在，其中以無機態(tài)氮（NH3、NH4+）對養(yǎng)殖的危害最大，毒性最強[3]。魚類對氨氮毒性非常敏感，氨氮可降低魚類生長速度，傷害魚體組織結(jié)構(gòu)、免疫功能、繁殖能力以及血液生化指標[4-6]。有學者認為，任何可以檢測出的氨氮對魚類的生長都會產(chǎn)生危害[7]。

錦鯉是經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）規(guī)定的5種試驗生物之一，也是我國主養(yǎng)的觀賞魚類。已有研究大多集中在氨氮對魚類的生長和酶活性的影響方面，很少有對魚類相關(guān)基因表達的影響研究[8-10]。本研究以錦鯉為試驗對象，以抗氧化酶和基因表達量變化為指標，同時研究氨氮暴露下對錦鯉相關(guān)體色基因表達的影響，研究氨氮對錦鯉的急性毒性作用，為氨氮生態(tài)風險評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗錦鯉，購于北京市十里河花鳥魚蟲市場。試驗魚平均體長（12.7±2.8） cm，平均體質(zhì)量（132.4±4.6） g，雌雄均有，魚體健康，規(guī)格相似。暴露試驗前，將試驗魚馴化10 d，水溫（25±1） ℃，采用曝氣自來水，每天光照8～10 h，每天定時投喂顆粒飼料1次，投喂總量為魚體質(zhì)量的2%～3%。養(yǎng)殖過程中及時換水并清除殘餌和代謝廢物。試驗魚自然死亡率<1%，試驗前24 h禁食。

氨氮儲備液：稱取氯化銨（分析純）用純凈水稀釋制成 10 g/L 的儲備液，備用。

1.2 試驗方法

試驗于2017年1月在北京市水產(chǎn)科學研究所小湯山良種繁育中心進行。

急性毒性試驗參照文獻[11]。

慢性毒性試驗：在96 h LC50半致死濃度下，設(shè)置8個處理濃度，分別為A（0.1×LC50）、B（0.2×LC50）、C（0.3×LC50）、D（0.4×LC50）、E（0.5×LC50）、F（0.6×LC50）、G（0.7×LC50）、H（0.8×LC50），并以曝氣純凈水為空白對照組。每個處理濃度設(shè)置3個平行，每缸25尾魚，水量100 L。每天全部換水1次，每天投喂2次，投喂總量為魚體質(zhì)量的2%～3%，進行慢性毒性試驗。每個質(zhì)量濃度組和對照組在放魚后的2、6、10、14 d分別取樣，用于抗氧化酶活性和基因表達的測定。

抗氧化酶活性測定：每個處理組取5尾魚，冰面解剖取肝臟組織，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）充分勻漿，4 ℃冷凍離心（12 000 r/min）20 min后取上清液，用于測定總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性。酶活性的測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。

抗氧化酶基因和體色基因表達量的測定：每個處理組取5尾魚，冰面解剖取肝臟、皮膚，液氮速凍，用TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒（TaKaRa）將定量的RNA反轉(zhuǎn)合成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，其間收集熒光信號?？寡趸富騝DNA片段擴增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃30 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，32個循環(huán)。體色基因cDNA片段擴增反應(yīng)條件：95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，36個循環(huán)。所有基因序列來自GenBank，引物信息見表1。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，用多重比較法進行組間差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對錦鯉的急性毒性效應(yīng)

通過急性毒性試驗，在高氨氮暴露下，錦鯉反應(yīng)遲鈍，游動遲緩，魚鰭和尾部有不同程度的腐爛，鰓部紅腫且黏液增多。由表2可知，總氨氮對錦鯉在24、48、72、96 h的半致死濃度（LC50）分別為51.34、42.53、31.18、27.29 mg/L，安全濃度為2.73 mg/L。

2.2 氨氮對錦鯉肝臟抗氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響

由表3可知，錦鯉暴露于氨氮初期（2 d），各試驗組總SOD活性與對照組無顯著差異，暴露中后期（6、10、14 d），各試驗組總SOD活性存在顯著差異（P<0.05），與對照組相比，A至E組總SOD活性顯著增加，而高濃度組F至H組總SOD活性顯著降低 （P<0.05）。 錦鯉暴露于氨氮初期、 中期（2、6、10 d），各試驗組CAT活性與對照組相比顯著增加（P<0.05）;暴露后期（14 d），各試驗組CAT活性與對照組相比顯著降低（P<0.05）。錦鯉暴露于氨氮初期、中期和后期（2、6、10、14 d），錦鯉肝臟AChE活性均受到顯著限制，且隨著暴露時間、濃度的增加，AChE活性明顯降低。

2.3 氨氮對錦鯉相關(guān)基因表達的影響

氨氮對錦鯉肝臟抗氧化酶基因AchE、Cyp450和皮膚體色基因Tyr、Mc1r表達量的影響見表4，可以看出，氨氮暴露后，錦鯉肝臟組織中AchE基因表達比率與對照組相比，受到顯著限制（P<0.05），且隨著暴露時間的增加，氨氮處理濃度的提高，AChE基因表達量顯著下降（P<0.05），與酶活性測定結(jié)果基本一致。Cyp450基因在暴露初期（2 d）和中期（6 d）無明顯變化，而在暴露中后期（10、14 d）表達量顯著下調(diào)（P<0.05），說明受到了抑制。由表4可知，皮膚體色基因Tyr、Mc1r的表達量在氨氮暴露后均明顯受到抑制。

3 討論

氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的一種重要環(huán)境污染因子，氨氮的危害可表現(xiàn)為大量消耗水體溶解氧而使水中缺氧并與氯作用生成氯胺，從而增加氧的消耗量，影響魚鰓的氧傳遞，濃度較高時導致魚類死亡，同時高濃度的氨氮還有可能形成亞硝胺，可致癌、致變異和致畸，對魚體有潛在威脅，可加速水體富營養(yǎng)化過程[12]。氨氮對水生生物的危害主要表現(xiàn)為非離子氨的危害，非離子氨進入生物體內(nèi)，會對酶水解反應(yīng)造成破壞。許多研究表明，高濃度氨氮脅迫對水生生物的免疫具有顯著的影響，尤其是長時間高濃度脅迫會導致機體免疫力下降。例如斑馬魚[13]、羅非魚[9]、黃顙魚[14]等魚類的死亡率隨著氨氮濃度的升高和時間的延長不斷提高，這與本試驗結(jié)果一致。由本試驗可知，毒性效應(yīng)與氨氮濃度和脅迫時間呈正相關(guān)。在本試驗中，氨氮對錦鯉24、48、72、96 h的半致死濃度（LC50）分別為51.34、42.53、31.18、27.29 mg/L，安全濃度為 2.73 mg/L。

超氧化物歧化酶是機體重要的抗氧化酶，它是生物體有效清除活性氧、防止活性氧合成和蓄積、阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)、保護細胞膜免受損傷的重要酶類之一，可反映機體免疫能力，被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[15]。過氧化氫酶是生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中重要的保護酶，起著催化H2O2分解、保護生物體組織免受毒害的重要作用。周瑩等研究氨氮對斑馬魚肝臟組織SOD活性的影響發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫后表現(xiàn)為低濃度促進、高濃度抑制的趨勢[13]。從本試驗結(jié)果可知，錦鯉受到氨氮脅迫的過程中，肝臟組織SOD和CAT活性在下降之前都有不同濃度、不同時間的上升規(guī)律，這與氨氮脅迫下斑馬魚的反應(yīng)相似。分析其原因可能是當水體中氨氮濃度較高時，機體在不同濃度、不同時間氨氮作用下，機體生物免疫力增高，即產(chǎn)生了“毒性興奮效應(yīng)”，而在本試驗后期（10、14 d）時，隨著時間的延長，錦鯉體內(nèi)氨氮積累了較高的毒性，體內(nèi)自由基防衛(wèi)系統(tǒng)受到破壞，促使過氧化氫、單線態(tài)氧等濃度增加，導致酶活性迅速下降，機體免疫失衡，因此SOD和CAT活性顯著下降。在本試驗中的不同脅迫濃度、不同脅迫時間處理下，AChE活性均受到抑制，這和周瑩等報道的氨氮濃度抑制斑馬魚AChE活性[13]一致。說明氨氮濃度的增加可迅速降低AChE活性，從而使機體免疫失衡。

生物機體在受到外界刺激后，在不同水平（蛋白、基因、細胞、組織器官）上均會發(fā)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕或者適應(yīng)污染物的壓力[16]。近年來，許多研究表明，污染物對基因表達水平的影響程度可以用來監(jiān)控其毒性。Wirzinger等認為，分子水平（DNA或RNA）的指示物具有清晰、明確、特異性更強的特點，且避免了后續(xù)翻譯與修飾過程中的干擾[17]。王麗等研究高效氯氰菊酯急性暴露中斑馬魚相關(guān)酶活性和基因表達變化的影響時發(fā)現(xiàn)，高效氯氰菊酯會抑制斑馬魚肝臟、腸和腦中AChE和CYP450的mRNA表達量[18]。Wu等的研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎暴露于一定濃度四溴雙酚A（TBBPA）時，Cu/Zn-SOD、CAT的mRNA表達下調(diào)[19]。在本研究中，于氨氮中暴露后，錦鯉肝臟組織中AchE基因表達與對照組相比受到顯著性限制，且隨著暴露時間的增加，氨氮處理濃度的提高，AChE基因表達量顯著下降，與酶活性測定結(jié)果基本一致。Cyp450基因在暴露初期（2 d）和中期（6 d）無明顯變化，而在暴露中后期（10、14 d）表達量明顯下調(diào)，這一結(jié)果與Wu等的研究結(jié)果類似[19]。這說明在高濃度氨氮暴露下，錦鯉氧化損傷嚴重，在短時間內(nèi)即可造成機體免疫失衡，產(chǎn)生較大的毒害作用。在本試驗中，皮膚體色基因Tyr、Mc1r的表達量在氨氮暴露后均明顯受到抑制，試驗期間試驗魚體色無光澤、暗淡，也說明氨氮可顯著影響錦鯉體色。

綜上所述，本研究獲得了氨氮對錦鯉的急性毒性結(jié)果和氨氮脅迫下抗氧化基因、皮膚體色基因轉(zhuǎn)錄量的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)氨氮對錦鯉免疫系統(tǒng)和體色因子有重要的損傷。綜合考慮，建議錦鯉養(yǎng)殖過程中氨氮濃度應(yīng)不高于1.6 mg/L。

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