劉淑霞　魏國江　孫宇峰　王廣達(dá)　韓如月　郭夢橋　王曉飛　肖宇　關(guān)向軍　郭永霞

摘要：研究輻射技術(shù)在紫花苜蓿誘變育種上的應(yīng)用，以60Co-γ射線輻照紫花苜蓿品種WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806的種子，測量不同劑量的60Co-γ對4個紫花苜蓿品種M1代的影響，結(jié)果表明，隨著60Co-γ輻射劑量的增加，紫花苜蓿的發(fā)芽率、出苗率、株高、株干質(zhì)量、株鮮質(zhì)量都明顯下降;葉綠素含量也呈現(xiàn)減少趨勢;不同紫花苜蓿品種葉片中丙二醛（MDA）含量隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)上升趨勢;不同紫花苜蓿品種葉片中過氧化氫酶（CAT）活性隨著60Co-r輻射劑量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這為開展紫花苜蓿誘變育種奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿;60Co-γ;誘變育種;生理特性;形態(tài)指標(biāo)

中圖分類號： S541+10.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0146-04

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為一種優(yōu)良的豆科牧草，具有營養(yǎng)價值高、適口性好等特點(diǎn)，在全國各地被廣泛種植[1]。在紫花苜蓿長期的栽培種植歷史進(jìn)程中，人類不斷地通過自然選擇、天然雜交和人工雜交等手段豐富其品種類型，但變異性小，育種目標(biāo)時間長、成本高。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和人們對苜蓿育種目標(biāo)的不斷創(chuàng)新研究，輻射誘變育種尤其是60Co-γ在輻射誘變育種中迫使紫花苜蓿自身的基因和染色體畸變，突變率高，可能創(chuàng)造出自然界沒有的新類型概率也高，并逐漸被研究者采納和利用，這種外界因素的作用有可能引起植物形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等多方面的變異，可在較短的時間內(nèi)培育出新品種[2-5]。近年來，眾多學(xué)者通過輻射農(nóng)作物、觀賞花卉、果樹類、牧草類等篩選出了大量的優(yōu)良品種，對60Co-γ輻射苜蓿的研究很多[6-9]，但是輻射后苜蓿生理生化發(fā)生的變化還未見系統(tǒng)報道，對今后開展輻射育種研究具有重要作用。本試驗(yàn)以WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806成熟苜蓿種子為材料，開展不同劑量的60Co-γ射線輻射處理，對4個紫花苜蓿品種的種子發(fā)芽率、幼苗生長、生理指標(biāo)等開展研究，以期確定適宜紫花苜蓿輻射誘變的劑量范圍，旨在為進(jìn)一步開展紫花苜蓿輻射育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806苜蓿種子于2016年10月初采自于黑龍江省大慶市星火牧場黑龍江省科學(xué)院大慶分院試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子輻射 由黑龍江省科學(xué)院技術(shù)物理研究所進(jìn)行60Co-γ輻射處理，輻射劑量分別為800、1 000、1 200、1 400、1 600 Gy，劑量率為15 Gy/min，每份處理500 g種子;以同批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對照。

1.2.2 種子處理 將不同劑量60Co-γ輻射處理后的紫花苜蓿種子用40 ℃的蒸餾水浸泡2 h，置于直徑為18.5 cm且有3層定性濾紙的培養(yǎng)皿中，每個處理各100粒紫花苜蓿種子，每個處理重復(fù)3次，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持適當(dāng)濕度。7 d后統(tǒng)計(jì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽率。

1.2.3 室內(nèi)栽培種植 將輻射處理后的種子于2017年5月10日進(jìn)行室內(nèi)Lenard系統(tǒng)種植[10]。每個塑料杯中種植預(yù)先準(zhǔn)備的籽粒飽滿大小一致的10粒苜蓿種子，每個處理種植30個塑料杯，全部生育過程都用Fahraeus無氮營養(yǎng)液[11]進(jìn)行種植。

1.2.4 形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)測定 出苗率：播種后每周統(tǒng)計(jì)不同處理的出苗情況，連續(xù)4周不再有出苗時終止。各處理以不再增加時的出苗率為最終出苗率。出苗率=出苗數(shù)/播種數(shù)×100%，出苗以子葉平展為標(biāo)準(zhǔn)。

株高：每個塑料杯隨機(jī)選取具有代表性的1株植株，測定株高（蛭石至植株頂端垂直距離），共計(jì)取樣10株。

干質(zhì)量和鮮質(zhì)量測定：在每個塑料杯中選取具有代表性的2株苜蓿，共計(jì)取樣20株進(jìn)行鮮草質(zhì)量測定和干草質(zhì)量測定。

葉綠素含量測定采用紫外分光光度法[12];丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)法[13];過氧化氫酶（CAT）活力測定采用紫外分光光度計(jì)法[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析及Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種種子發(fā)芽率的影響

從表1可以看出，不同紫花苜蓿品種在60Co-γ輻射作用下，隨著輻射劑量的增加，不同紫花苜蓿品種種子的發(fā)芽率均呈現(xiàn)下降的趨勢。60Co-γ輻射處理后，無論是高劑量處理還是低劑量處理不同苜蓿品種種子的發(fā)芽率均低于對照。WL319在800 Gy輻射劑量下的發(fā)芽率與對照差異不顯著，其他劑量下的發(fā)芽率與這兩者均差異顯著，1 000、1 200 Gy 劑量下差異不顯著，1 400、1 600 Gy劑量下的發(fā)芽率與1 000、1 200 Gy 劑量下的發(fā)芽率與這兩者均差異顯著。斯貝德在0、800、1 000 Gy下劑量差異不顯著，1 200、1 400、1 600 Gy劑量0、800 Gy劑量下的發(fā)芽率與差異顯著，1 000、1 200 Gy劑量間差異不顯著。巨能耐鹽0 Gy與800 Gy劑量下的發(fā)芽率與對照差異不顯著，其他輻射劑量對0、800 Gy差異顯著。龍牧806發(fā)芽率0、800、1 000 Gy劑量差異不顯著，1 000 Gy與 1 200 Gy 劑量間的發(fā)芽率差異不顯著，1 200、1 400、1 600 Gy 劑量下的發(fā)芽率與0、800 Gy劑量下的發(fā)芽率差異顯著。

2.2 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種種子出苗率的影響

種子出苗率是種子活力的直接表現(xiàn)，同時也可反映種子發(fā)芽以及正常破土生長的能力。由表2可知，不同60Co-γ輻射劑量處理不同紫花苜蓿品種的種子對其出苗率具有不同程度的影響。60Co-γ輻射處理后，供試的4個品種（WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806）的出苗情況均隨著輻射劑量的增加而受到抑制，不同苜蓿品種隨著輻射劑量的增加出苗率整體上顯著下降。

2.3 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種幼苗生長的影響

2.3.1 60Co-γ輻射處理后對不同品種苜蓿幼苗株高的影響 60Co-γ 輻射處理后不同苜蓿幼苗的株高見表3，60Co-γ輻射處理對4個紫花苜蓿品種的株高生長均有不同程度的影響。800 Gy輻射處理對WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806等4個紫花苜蓿品種的幼苗生長具有促進(jìn)生長的作用，與對照相比增高率分別為8.19%、6.36%、9.11%、9.79%，但均與對照差異不顯著。1 000、1 200、1 400、1 600 Gy這4個輻射劑量對4個紫花苜蓿品種的幼苗生長均具有抑制作用;1 000 Gy 劑量下的抑制率分別為9.35%、8.75%、5.66%、585%;1 200 Gy 劑量下的抑制率分別為25.20%、24.57%、24.46%、22.58%;1 400 Gy劑量下的抑制率分別為40.56%、39.21%、35.29%、38.58%;1 600 Gy 劑量下的抑制率分別為58.50%、73.55%、57.98%、59.29%。

2.3.2 60Co-γ輻射處理后對不同品種苜蓿幼苗株鮮質(zhì)量和株干質(zhì)量的影響 60Co-γ輻射處理對4個紫花苜蓿品種幼苗期植株的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均有不同程度的影響，從表3可以看出，800 Gy輻射處理對WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806等4個紫花苜蓿品種的幼苗株干質(zhì)量和株鮮質(zhì)量均具有促進(jìn)作用。其余劑量處理之后，隨著60Co-γ輻射劑量的增加，對4個紫花苜蓿品種的株鮮質(zhì)量和株干質(zhì)量抑制作用增加。但0、800、1 000 Gy 3個劑量對不同紫花苜蓿品種的株鮮質(zhì)量和株干質(zhì)量的影響差異不顯著。1 200、1 400、1 600 Gy輻射劑量處理與0、800、1 000 Gy 輻射劑量處理對各紫花苜蓿品種的影響均存在顯著性差異。

2.4 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種葉綠素含量的影響

從圖1可以看出，隨著60Co-γ輻射劑量的增大，各個紫花苜蓿品種的葉綠素含量逐漸降低。當(dāng)60Co-γ輻射劑量超過1 600 Gy后，4個紫花苜蓿品種的葉綠素含量降低明顯，降幅均達(dá)45%以上，其中巨能耐鹽的降低幅度達(dá)到了53.16%。

2.5 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種生理特性的影響

2.5.1 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種葉片中MDA含量的影響 60Co-γ輻射對紫花苜蓿膜脂過氧化水平的影響見圖2，4個紫花苜蓿品種的MDA含量隨著60Co-γ輻射劑量的增加而升高，但不同的紫花苜蓿品種MDA含量變化存在明顯差異。巨能耐鹽苜蓿中MDA含量增加幅度明顯高于其他3個紫花苜蓿品種，在1 600 Gy 60Co-γ輻射水平下，巨能耐鹽苜蓿品種的MDA含量比對照增加了296.69%，而WL319、斯貝德、龍牧806的增幅分別為272.95%、288.76%、267.85%。表明巨能耐鹽紫花苜蓿品種的膜脂過氧化水平最高，受害程度最嚴(yán)重，抗性最弱;而龍牧806紫花苜蓿品種MDA含量的增幅最小，抗性最強(qiáng)。

2.5.2 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種葉片中CAT活性的影響 從圖3可以看出，4個紫花苜蓿品種的CAT活性隨著60Co-γ輻射劑量的增加均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但不同紫花苜蓿品種隨濃度變化的趨勢不同。60Co-γ輻射劑量為 1 200 Gy 時，WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806的CAT活性均達(dá)到峰值，分別比對照增加了160.84%、78.43%、58.56%、165.63%。之后隨著60Co-γ輻射劑量的增加，CAT活性出現(xiàn)下降趨勢。60Co-γ輻射劑量為1 600 Gy時，巨能耐鹽紫花苜蓿品種的CAT活性降低了89.97%，斯貝德CAT活性降低86.89%，WL319的CAT活性降低64.42%，龍牧806紫花苜蓿品種的CAT活性降幅最小，為63.28%。由此可以看出，60Co-γ輻射處理劑量較大時，紫花苜蓿CAT活性受到了抑制，清除活性氧能力下降，生長受到抑制。從CAT活性的變化來看，高劑量的 60Co-γ 輻射處理下4個紫花苜蓿品種中龍牧806紫花苜蓿品種的CAT活性降幅最小，受傷害程度最小，巨能耐鹽品種受傷害程度最大。

3 結(jié)論與討論

3.1 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種生長量的影響

植物在受到外來刺激后，一般會出現(xiàn)一系列的生物學(xué)效應(yīng)，紫花苜蓿的生長狀況是紫花苜蓿經(jīng)輻射后生物學(xué)效應(yīng)的重要參考指標(biāo)。苜蓿生長發(fā)育可作為輻射等刺激處理后種子活力的指標(biāo)之一。眾多學(xué)者研究表明，通過輻射能引起植物的形態(tài)指標(biāo)發(fā)生改變，通常低劑量的60Co-γ輻射處理發(fā)生突變或者畸形的頻率低，不能達(dá)到預(yù)期的效果，但能改變植物的信號傳導(dǎo)。次生代謝產(chǎn)物的合成，植物體內(nèi)的應(yīng)急反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)生改變使其更好地抵御60Co-γ輻射帶來的刺激[15-17]。本試驗(yàn)中紫花苜蓿在受到60Co-γ輻射處理后，不同紫花苜蓿品種的發(fā)芽率、出苗率、株高、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量都顯著下降，這可能是60Co-γ輻射處理對紫花苜蓿均有不同程度的損害，抑制苗株高、出苗率、干物質(zhì)積累等。李瑜等研究發(fā)現(xiàn)，60Co-γ 輻射劑量在100 Gy時可抑制桂花的株高、干物質(zhì)的積累和出苗率[18]，本研究的結(jié)論與之一致。Zaka等的研究表明，大于 6 Gy 的60Co-γ輻射劑量就能嚴(yán)重影響豌豆的生長[19]。由此可以看出，不同植物種類對于60Co-γ輻射的敏感性有很大差異，這可能是植物本身基因組差異有關(guān)。

3.2 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種光合色素的影響

本試驗(yàn)中不同紫花苜蓿品種在受到60Co-γ輻射處理時，隨著60Co-γ輻射劑量的增大，不同紫花苜蓿品種葉綠素含量逐漸降低，在此過程中，紫花苜蓿在60Co-γ輻射作用下均抑制葉綠素的產(chǎn)生，這一結(jié)果與李瑜等的研究結(jié)論[18]一致。相關(guān)學(xué)者認(rèn)為，60Co-γ輻射抑制紫花苜蓿中葉綠素的產(chǎn)生，可能是60Co-γ輻射引起了紫花苜蓿自身類囊體的擴(kuò)張，阻礙了紫花苜蓿葉內(nèi)同化產(chǎn)物的運(yùn)轉(zhuǎn)及葉綠素的合成，改變光合作用過程，進(jìn)而對紫花苜蓿品種起到保護(hù)作用。

3.3 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種酶活性的影響

在受到不良外界因素刺激時，植物本身的抗氧化劑和抗氧化酶能有效清除活性氧的毒害，調(diào)節(jié)植物正常生理生化過程，維持植物自身細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。本試驗(yàn)中紫花苜蓿葉片中MDA的含量隨著60Co-γ輻射劑量的增加而提高。高劑量的60Co-γ輻射使紫花苜蓿的膜脂過氧化程度發(fā)生變化，MDA的含量增加。低劑量的60Co-γ輻射CAT的活性先上升出現(xiàn)自我保護(hù)現(xiàn)象，高劑量輻射時，CAT活性下降，CAT活性受到了抑制，清除活性氧能力下降，生長受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果與李瑜等研究桂花、Vandenhove等研究擬南芥等得出的結(jié)論[18，20]一致。

3.4 60Co-γ輻射對不同紫花苜蓿品種敏感性的影響

不同植物種子的品種特性、生理狀態(tài)不同，在受到外界刺激后作出的應(yīng)急反應(yīng)也不盡相同。不同紫花苜蓿品種在受到60Co-γ輻射處理后，種子自身在生長發(fā)育過程中生理狀態(tài)也會發(fā)生變化[21-22]。一般情況下，60Co-γ輻射劑量越大，植物出現(xiàn)變異的概率會加大，出苗率會下降;相反60Co-γ輻射劑量過小，植物材料受到外界的影響和刺激就小，出現(xiàn)變異的概率就會降低，從而不能達(dá)到60Co-γ輻射處理預(yù)期的目標(biāo)。因此，在輻射育種中劑量的選擇尤為重要。本試驗(yàn)參照前人的研究結(jié)果[23-24]，并根據(jù)實(shí)際情況選擇了60Co-γ輻射范圍為800～1 600 Gy的輻射劑量，本試驗(yàn)結(jié)果表明，大于 1 400 Gy 的輻射劑量不同紫花苜蓿品種的出苗率約為50%。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)紫花苜蓿種子的成熟度、清潔度、含水量等指標(biāo)的不同及試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)對輻射劑量進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

參考文獻(xiàn)：

[1]王 偉，王 巖，趙天宏，等. 刈割對UV-B輻射增強(qiáng)下紫花苜蓿光合及熒光特性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2016，35（7）：1721-1729.

[2]劉天增，謝新春，張巨明. 海濱雀稗60Co-γ輻射誘變突變體篩選[J]. 草業(yè)學(xué)報，2017，26（7）：62-70.

[3]劉艷芝，徐祥文，王淑霞，等. 60Co-γ射線對山藥零余子的輻射效應(yīng)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（4）：54-56，60.

[4]秦獻(xiàn)泉，徐 寧，朱建華，等. 荔枝枝條輻射生物學(xué)效應(yīng)研究初報[J]. 種子，2016，35（7）：5-9.

[5]李 偉，吳 超，李正和，等. 60Co-γ輻射對香軟型水稻品種‘滇屯502的誘變效應(yīng)[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)），2016，31（1）：7-15.

[6]汪 航. 三種羊蹄甲SRAP親緣關(guān)系分析及羊蹄甲的輻射誘變育種初探[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[7]王 偉，趙藝欣，郭書嫄，等. UV-B輻射增強(qiáng)對紫花苜蓿光合特性及膜脂過氧化的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（10）：324-327.

[8]Shen X H. Effects of mutagens on antioxidant enzymes activity and cold resistance of alfalfa[J]. Agricultural Science and Technology，2017，9：2-5.

[9]王 偉，王 巖，梁變變，等. 初花期噴鑭對UV-B輻射增強(qiáng)下紫花苜蓿光合及熒光特性的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)氣象，2017，38（4）：230-239.

[10]楊青川，康俊梅，張鐵軍，等. 苜蓿種質(zhì)資源的分布、育種與利用[J]. 科學(xué)通報，2016，61（2）：261-270.

[11]Trung B C，Yoshida S. Improvement of leonard jar assembly for screening of effective rhizobium[J]. Soil Science and Plant Nutrition，1983，29（1）：97-100.

[12]龐丹波，李生寶，潘占兵，等. 紫花苜蓿引種試驗(yàn)初報[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44（7）：143-147.

[13]趙 萌，魏小紅. 吸脹冷害下外源NO對紫花苜蓿種子萌發(fā)及抗氧化性的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報，2015，24（4）：87-94.

[14]徐海鵬，李慧萍，金小煜，等. 草地早熟禾愈傷組織對NaCl脅迫的生理響應(yīng)[J]. 草業(yè)科學(xué)，2016，33（1）：86-92.

[15]El-Sharkawy M S，El-Beshsbeshy T R，Mahmoud E K，et al. Response of alfalfa under salt stress to the application of potassium sulfate nanoparticles[J]. American Journal of Plant Sciences，2017，8（8）：1751.

[16]耿興敏，王良桂，李 娜，等. 60Co-γ輻射對桂花種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2016，30（2）：216-223.

[17]Gu Q，Chen Z P，Cui W，et al. Methane alleviates alfalfa cadmium toxicity via decreasing cadmium accumulation and reestablishing glutathione homeostasis[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2018，147：861-871.

[18]李 瑜，王 萍，耿興敏，等. 60Co-γ輻射對桂花幼苗生長及生理指標(biāo)的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，26（1）：61-69.

[19]Zaka R，Chenal C，Misset M T. Effects of low doses of short-term gamma irradiation on growth and development through two generations of Pisum sativum[J]. Science of the Total Environment，2004，320（2）：121-129.

[20]Vandenhove H，Vanhoudt N，Cuypers A，et al. Life-cycle chronic gamma exposure of Arabidopsis thaliana induces growth effects but no discernable effects on oxidative stress pathways[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（9）：778-786.

[21]El-Sharkawy M，El-Beshsbeshy T，Al-Shal R，et al. Effect of plant growth stimulants on alfalfa response to salt stress[J]. Agricultural Sciences，2017，8（4）：267.

[22]蔡智才，畢華興，許華森，等. 晉西黃土區(qū)蘋果花生間作系統(tǒng)光合有效輻射及其對花生生長的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2017，45（4）：51-58.

[23]李 波，李祥莉，趙宇佳，等. 60Co-γ射線對無芒雀麥種子的輻照效應(yīng)[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)），2017，32（5）：756-761.

[24]徐佳琦，戚嘉敏，朱 雯，等. 60Co-γ輻照對洋紫荊種子發(fā)芽及幼苗生長的影響[J]. 林業(yè)與環(huán)境科學(xué)，2016，32（5）：58-62.史東杰，朱 華，張 欣，等. 氨氮對錦鯉相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：150-153.