劉淑霞　魏國江　孫宇峰　王廣達(dá)　韓如月　郭夢橋　王曉飛　肖宇　關(guān)向軍　郭永霞

摘要：研究輻射技術(shù)在紫花苜蓿誘變育種上的應(yīng)用，以60Co-γ射線輻照紫花苜蓿品種WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806的種子，測量不同劑量的60Co-γ對(duì)4個(gè)紫花苜蓿品種M1代的影響，結(jié)果表明，隨著60Co-γ輻射劑量的增加，紫花苜蓿的發(fā)芽率、出苗率、株高、株干質(zhì)量、株鮮質(zhì)量都明顯下降;葉綠素含量也呈現(xiàn)減少趨勢;不同紫花苜蓿品種葉片中丙二醛（MDA）含量隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)上升趨勢;不同紫花苜蓿品種葉片中過氧化氫酶（CAT）活性隨著60Co-r輻射劑量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這為開展紫花苜蓿誘變育種奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿;60Co-γ;誘變育種;生理特性;形態(tài)指標(biāo)

中圖分類號(hào)： S541+10.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0146-04

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為一種優(yōu)良的豆科牧草，具有營養(yǎng)價(jià)值高、適口性好等特點(diǎn)，在全國各地被廣泛種植[1]。在紫花苜蓿長期的栽培種植歷史進(jìn)程中，人類不斷地通過自然選擇、天然雜交和人工雜交等手段豐富其品種類型，但變異性小，育種目標(biāo)時(shí)間長、成本高。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和人們對(duì)苜蓿育種目標(biāo)的不斷創(chuàng)新研究，輻射誘變育種尤其是60Co-γ在輻射誘變育種中迫使紫花苜蓿自身的基因和染色體畸變，突變率高，可能創(chuàng)造出自然界沒有的新類型概率也高，并逐漸被研究者采納和利用，這種外界因素的作用有可能引起植物形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等多方面的變異，可在較短的時(shí)間內(nèi)培育出新品種[2-5]。近年來，眾多學(xué)者通過輻射農(nóng)作物、觀賞花卉、果樹類、牧草類等篩選出了大量的優(yōu)良品種，對(duì)60Co-γ輻射苜蓿的研究很多[6-9]，但是輻射后苜蓿生理生化發(fā)生的變化還未見系統(tǒng)報(bào)道，對(duì)今后開展輻射育種研究具有重要作用。本試驗(yàn)以WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806成熟苜蓿種子為材料，開展不同劑量的60Co-γ射線輻射處理，對(duì)4個(gè)紫花苜蓿品種的種子發(fā)芽率、幼苗生長、生理指標(biāo)等開展研究，以期確定適宜紫花苜蓿輻射誘變的劑量范圍，旨在為進(jìn)一步開展紫花苜蓿輻射育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806苜蓿種子于2016年10月初采自于黑龍江省大慶市星火牧場黑龍江省科學(xué)院大慶分院試驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子輻射 由黑龍江省科學(xué)院技術(shù)物理研究所進(jìn)行60Co-γ輻射處理，輻射劑量分別為800、1 000、1 200、1 400、1 600 Gy，劑量率為15 Gy/min，每份處理500 g種子;以同批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對(duì)照。

1.2.2 種子處理 將不同劑量60Co-γ輻射處理后的紫花苜蓿種子用40 ℃的蒸餾水浸泡2 h，置于直徑為18.5 cm且有3層定性濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理各100粒紫花苜蓿種子，每個(gè)處理重復(fù)3次，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持適當(dāng)濕度。7 d后統(tǒng)計(jì)紫花苜蓿種子的發(fā)芽率。

1.2.3 室內(nèi)栽培種植 將輻射處理后的種子于2017年5月10日進(jìn)行室內(nèi)Lenard系統(tǒng)種植[10]。每個(gè)塑料杯中種植預(yù)先準(zhǔn)備的籽粒飽滿大小一致的10粒苜蓿種子，每個(gè)處理種植30個(gè)塑料杯，全部生育過程都用Fahraeus無氮營養(yǎng)液[11]進(jìn)行種植。

1.2.4 形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)測定 出苗率：播種后每周統(tǒng)計(jì)不同處理的出苗情況，連續(xù)4周不再有出苗時(shí)終止。各處理以不再增加時(shí)的出苗率為最終出苗率。出苗率=出苗數(shù)/播種數(shù)×100%，出苗以子葉平展為標(biāo)準(zhǔn)。

株高：每個(gè)塑料杯隨機(jī)選取具有代表性的1株植株，測定株高（蛭石至植株頂端垂直距離），共計(jì)取樣10株。

干質(zhì)量和鮮質(zhì)量測定：在每個(gè)塑料杯中選取具有代表性的2株苜蓿，共計(jì)取樣20株進(jìn)行鮮草質(zhì)量測定和干草質(zhì)量測定。

葉綠素含量測定采用紫外分光光度法[12];丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)法[13];過氧化氫酶（CAT）活力測定采用紫外分光光度計(jì)法[14]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析及Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種種子發(fā)芽率的影響

從表1可以看出，不同紫花苜蓿品種在60Co-γ輻射作用下，隨著輻射劑量的增加，不同紫花苜蓿品種種子的發(fā)芽率均呈現(xiàn)下降的趨勢。60Co-γ輻射處理后，無論是高劑量處理還是低劑量處理不同苜蓿品種種子的發(fā)芽率均低于對(duì)照。WL319在800 Gy輻射劑量下的發(fā)芽率與對(duì)照差異不顯著，其他劑量下的發(fā)芽率與這兩者均差異顯著，1 000、1 200 Gy 劑量下差異不顯著，1 400、1 600 Gy劑量下的發(fā)芽率與1 000、1 200 Gy 劑量下的發(fā)芽率與這兩者均差異顯著。斯貝德在0、800、1 000 Gy下劑量差異不顯著，1 200、1 400、1 600 Gy劑量0、800 Gy劑量下的發(fā)芽率與差異顯著，1 000、1 200 Gy劑量間差異不顯著。巨能耐鹽0 Gy與800 Gy劑量下的發(fā)芽率與對(duì)照差異不顯著，其他輻射劑量對(duì)0、800 Gy差異顯著。龍牧806發(fā)芽率0、800、1 000 Gy劑量差異不顯著，1 000 Gy與 1 200 Gy 劑量間的發(fā)芽率差異不顯著，1 200、1 400、1 600 Gy 劑量下的發(fā)芽率與0、800 Gy劑量下的發(fā)芽率差異顯著。

2.2 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種種子出苗率的影響

種子出苗率是種子活力的直接表現(xiàn)，同時(shí)也可反映種子發(fā)芽以及正常破土生長的能力。由表2可知，不同60Co-γ輻射劑量處理不同紫花苜蓿品種的種子對(duì)其出苗率具有不同程度的影響。60Co-γ輻射處理后，供試的4個(gè)品種（WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806）的出苗情況均隨著輻射劑量的增加而受到抑制，不同苜蓿品種隨著輻射劑量的增加出苗率整體上顯著下降。

2.3 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗生長的影響

2.3.1 60Co-γ輻射處理后對(duì)不同品種苜蓿幼苗株高的影響 60Co-γ 輻射處理后不同苜蓿幼苗的株高見表3，60Co-γ輻射處理對(duì)4個(gè)紫花苜蓿品種的株高生長均有不同程度的影響。800 Gy輻射處理對(duì)WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806等4個(gè)紫花苜蓿品種的幼苗生長具有促進(jìn)生長的作用，與對(duì)照相比增高率分別為8.19%、6.36%、9.11%、9.79%，但均與對(duì)照差異不顯著。1 000、1 200、1 400、1 600 Gy這4個(gè)輻射劑量對(duì)4個(gè)紫花苜蓿品種的幼苗生長均具有抑制作用;1 000 Gy 劑量下的抑制率分別為9.35%、8.75%、5.66%、585%;1 200 Gy 劑量下的抑制率分別為25.20%、24.57%、24.46%、22.58%;1 400 Gy劑量下的抑制率分別為40.56%、39.21%、35.29%、38.58%;1 600 Gy 劑量下的抑制率分別為58.50%、73.55%、57.98%、59.29%。

2.3.2 60Co-γ輻射處理后對(duì)不同品種苜蓿幼苗株鮮質(zhì)量和株干質(zhì)量的影響 60Co-γ輻射處理對(duì)4個(gè)紫花苜蓿品種幼苗期植株的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均有不同程度的影響，從表3可以看出，800 Gy輻射處理對(duì)WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806等4個(gè)紫花苜蓿品種的幼苗株干質(zhì)量和株鮮質(zhì)量均具有促進(jìn)作用。其余劑量處理之后，隨著60Co-γ輻射劑量的增加，對(duì)4個(gè)紫花苜蓿品種的株鮮質(zhì)量和株干質(zhì)量抑制作用增加。但0、800、1 000 Gy 3個(gè)劑量對(duì)不同紫花苜蓿品種的株鮮質(zhì)量和株干質(zhì)量的影響差異不顯著。1 200、1 400、1 600 Gy輻射劑量處理與0、800、1 000 Gy 輻射劑量處理對(duì)各紫花苜蓿品種的影響均存在顯著性差異。

2.4 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種葉綠素含量的影響

從圖1可以看出，隨著60Co-γ輻射劑量的增大，各個(gè)紫花苜蓿品種的葉綠素含量逐漸降低。當(dāng)60Co-γ輻射劑量超過1 600 Gy后，4個(gè)紫花苜蓿品種的葉綠素含量降低明顯，降幅均達(dá)45%以上，其中巨能耐鹽的降低幅度達(dá)到了53.16%。

2.5 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種生理特性的影響

2.5.1 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種葉片中MDA含量的影響 60Co-γ輻射對(duì)紫花苜蓿膜脂過氧化水平的影響見圖2，4個(gè)紫花苜蓿品種的MDA含量隨著60Co-γ輻射劑量的增加而升高，但不同的紫花苜蓿品種MDA含量變化存在明顯差異。巨能耐鹽苜蓿中MDA含量增加幅度明顯高于其他3個(gè)紫花苜蓿品種，在1 600 Gy 60Co-γ輻射水平下，巨能耐鹽苜蓿品種的MDA含量比對(duì)照增加了296.69%，而WL319、斯貝德、龍牧806的增幅分別為272.95%、288.76%、267.85%。表明巨能耐鹽紫花苜蓿品種的膜脂過氧化水平最高，受害程度最嚴(yán)重，抗性最弱;而龍牧806紫花苜蓿品種MDA含量的增幅最小，抗性最強(qiáng)。

2.5.2 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種葉片中CAT活性的影響 從圖3可以看出，4個(gè)紫花苜蓿品種的CAT活性隨著60Co-γ輻射劑量的增加均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但不同紫花苜蓿品種隨濃度變化的趨勢不同。60Co-γ輻射劑量為 1 200 Gy 時(shí)，WL319、斯貝德、巨能耐鹽、龍牧806的CAT活性均達(dá)到峰值，分別比對(duì)照增加了160.84%、78.43%、58.56%、165.63%。之后隨著60Co-γ輻射劑量的增加，CAT活性出現(xiàn)下降趨勢。60Co-γ輻射劑量為1 600 Gy時(shí)，巨能耐鹽紫花苜蓿品種的CAT活性降低了89.97%，斯貝德CAT活性降低86.89%，WL319的CAT活性降低64.42%，龍牧806紫花苜蓿品種的CAT活性降幅最小，為63.28%。由此可以看出，60Co-γ輻射處理劑量較大時(shí)，紫花苜蓿CAT活性受到了抑制，清除活性氧能力下降，生長受到抑制。從CAT活性的變化來看，高劑量的 60Co-γ 輻射處理下4個(gè)紫花苜蓿品種中龍牧806紫花苜蓿品種的CAT活性降幅最小，受傷害程度最小，巨能耐鹽品種受傷害程度最大。

3 結(jié)論與討論

3.1 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種生長量的影響

植物在受到外來刺激后，一般會(huì)出現(xiàn)一系列的生物學(xué)效應(yīng)，紫花苜蓿的生長狀況是紫花苜蓿經(jīng)輻射后生物學(xué)效應(yīng)的重要參考指標(biāo)。苜蓿生長發(fā)育可作為輻射等刺激處理后種子活力的指標(biāo)之一。眾多學(xué)者研究表明，通過輻射能引起植物的形態(tài)指標(biāo)發(fā)生改變，通常低劑量的60Co-γ輻射處理發(fā)生突變或者畸形的頻率低，不能達(dá)到預(yù)期的效果，但能改變植物的信號(hào)傳導(dǎo)。次生代謝產(chǎn)物的合成，植物體內(nèi)的應(yīng)急反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)生改變使其更好地抵御60Co-γ輻射帶來的刺激[15-17]。本試驗(yàn)中紫花苜蓿在受到60Co-γ輻射處理后，不同紫花苜蓿品種的發(fā)芽率、出苗率、株高、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量都顯著下降，這可能是60Co-γ輻射處理對(duì)紫花苜蓿均有不同程度的損害，抑制苗株高、出苗率、干物質(zhì)積累等。李瑜等研究發(fā)現(xiàn)，60Co-γ 輻射劑量在100 Gy時(shí)可抑制桂花的株高、干物質(zhì)的積累和出苗率[18]，本研究的結(jié)論與之一致。Zaka等的研究表明，大于 6 Gy 的60Co-γ輻射劑量就能嚴(yán)重影響豌豆的生長[19]。由此可以看出，不同植物種類對(duì)于60Co-γ輻射的敏感性有很大差異，這可能是植物本身基因組差異有關(guān)。

3.2 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種光合色素的影響

本試驗(yàn)中不同紫花苜蓿品種在受到60Co-γ輻射處理時(shí)，隨著60Co-γ輻射劑量的增大，不同紫花苜蓿品種葉綠素含量逐漸降低，在此過程中，紫花苜蓿在60Co-γ輻射作用下均抑制葉綠素的產(chǎn)生，這一結(jié)果與李瑜等的研究結(jié)論[18]一致。相關(guān)學(xué)者認(rèn)為，60Co-γ輻射抑制紫花苜蓿中葉綠素的產(chǎn)生，可能是60Co-γ輻射引起了紫花苜蓿自身類囊體的擴(kuò)張，阻礙了紫花苜蓿葉內(nèi)同化產(chǎn)物的運(yùn)轉(zhuǎn)及葉綠素的合成，改變光合作用過程，進(jìn)而對(duì)紫花苜蓿品種起到保護(hù)作用。

3.3 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種酶活性的影響

在受到不良外界因素刺激時(shí)，植物本身的抗氧化劑和抗氧化酶能有效清除活性氧的毒害，調(diào)節(jié)植物正常生理生化過程，維持植物自身細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。本試驗(yàn)中紫花苜蓿葉片中MDA的含量隨著60Co-γ輻射劑量的增加而提高。高劑量的60Co-γ輻射使紫花苜蓿的膜脂過氧化程度發(fā)生變化，MDA的含量增加。低劑量的60Co-γ輻射CAT的活性先上升出現(xiàn)自我保護(hù)現(xiàn)象，高劑量輻射時(shí)，CAT活性下降，CAT活性受到了抑制，清除活性氧能力下降，生長受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果與李瑜等研究桂花、Vandenhove等研究擬南芥等得出的結(jié)論[18，20]一致。

3.4 60Co-γ輻射對(duì)不同紫花苜蓿品種敏感性的影響

不同植物種子的品種特性、生理狀態(tài)不同，在受到外界刺激后作出的應(yīng)急反應(yīng)也不盡相同。不同紫花苜蓿品種在受到60Co-γ輻射處理后，種子自身在生長發(fā)育過程中生理狀態(tài)也會(huì)發(fā)生變化[21-22]。一般情況下，60Co-γ輻射劑量越大，植物出現(xiàn)變異的概率會(huì)加大，出苗率會(huì)下降;相反60Co-γ輻射劑量過小，植物材料受到外界的影響和刺激就小，出現(xiàn)變異的概率就會(huì)降低，從而不能達(dá)到60Co-γ輻射處理預(yù)期的目標(biāo)。因此，在輻射育種中劑量的選擇尤為重要。本試驗(yàn)參照前人的研究結(jié)果[23-24]，并根據(jù)實(shí)際情況選擇了60Co-γ輻射范圍為800～1 600 Gy的輻射劑量，本試驗(yàn)結(jié)果表明，大于 1 400 Gy 的輻射劑量不同紫花苜蓿品種的出苗率約為50%。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)紫花苜蓿種子的成熟度、清潔度、含水量等指標(biāo)的不同及試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)對(duì)輻射劑量進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

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