呂孫建　袁雪梅　劉莉　盧淑娟　杭小英　施偉達

摘要：針對1株從中華鱉養(yǎng)殖塘中分離得到的寬譜噬菌體NTHP01（保藏號：CGMCC No. 9623），對其感染復(fù)數(shù)、潛伏期和裂解期、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等理化特性展開研究，探討了氯化鎂促噬菌體感染的最佳濃度，并考察了該噬菌體的噬菌譜。結(jié)果顯示，噬菌體NTHP01的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01，潛伏期和裂解期分別為150、60 min，最適溫度為 30 ℃，最適pH值為7，氯化鎂終濃度為4 mmol/L時對噬菌體的感染促進作用最佳。此外，結(jié)果顯示噬菌體NTHP01宿主范圍寬，能夠有效抑制來自不同水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的細菌，包括嗜水氣單胞菌、腦膜膿毒性黃桿菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血性弧菌、維氏氣單胞菌、腐敗希瓦菌、溫和氣單胞菌等。研究結(jié)果為噬菌體NTHP01的規(guī)?；苽浼敖窈笤谒a(chǎn)養(yǎng)殖細菌性病害防治中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：噬菌體;生理特征;抑菌作用;宿主范圍

中圖分類號： S947.1+2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0132-03

細菌性病害是水產(chǎn)養(yǎng)殖的常見病害，長期以來，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中發(fā)揮著重要作用，但由此引發(fā)的耐藥菌增加、藥物殘留、水體環(huán)境生態(tài)問題等不良后果[1-2]，已引起社會的廣泛關(guān)注，無抗生素養(yǎng)殖的技術(shù)支撐需求凸顯。噬菌體作為天然的生物抗菌制劑，具有見效快、無毒害、無污染等特點，可能替代抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性病害防治方面發(fā)揮重要作用。噬菌體是一種以細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物作為宿主的病毒，因此在許多細菌聚集的區(qū)域都能找到噬菌體，它能夠特異性地殺死宿主菌，達到預(yù)防和治療的目的。噬菌體作為細菌性病害控制的方法之一，相關(guān)研究已在醫(yī)學(xué)、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域被關(guān)注和重視。2005年，Bruttin和Brussow[3]臨床試驗驗證了噬菌體在使用、治療過程中的安全性。目前，已有的文獻報道發(fā)現(xiàn)噬菌體對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[4]、沙門氏菌（Salmonella）[5]、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）[6]等細菌均有較好的抑制效果。

本實驗室從中華鱉養(yǎng)殖塘中分離純化獲得1株噬菌體NTHP01（保藏號：CGMCC No. 9623），前期研究發(fā)現(xiàn)對中華鱉一些細菌性病害有較好的防治作用。為進一步拓展該噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，本研究對該噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）、潛伏期、暴發(fā)期、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等理化特性進行測定，同時還探討了陽離子化合物氯化鎂促進噬菌體感染的最佳濃度，以及噬菌體對水產(chǎn)養(yǎng)殖常見致病菌的抑菌效果，為后續(xù)規(guī)?；a(chǎn)并應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗所用嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、腦膜膿毒性金黃桿菌（Elizabethkingia meningoseptic）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）分離自中華鱉養(yǎng)殖池，副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）分離自南美白對蝦養(yǎng)殖池，腐敗希瓦菌（Shewanella putrefaciens）分離自紅螯螯蝦養(yǎng)殖池，溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）分離自鱸魚養(yǎng)殖池，試驗用細菌均保存于浙江省淡水水產(chǎn)研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 噬菌體培養(yǎng)按試驗內(nèi)容不同分別采用TSB液體培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為2%）和半固體培養(yǎng)基（瓊脂濃度為1.2%）進行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 最適感染復(fù)數(shù)（MOI）測定 感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）是指感染時噬菌體與指示菌數(shù)量的比值。將已知濃度噬菌體稀釋至1×108 PFU/mL，再進行10倍梯度分別稀釋至1×107、1×106、1×105 PFU/mL;同時將宿主菌（維氏氣單胞菌）搖至1×108 CFU/mL，同樣稀釋至1×107、1×106、1×105 CFU/mL。按表1進行7個不同MOI（1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001）各取100 μL在 1.5 mL Eppendorf管中混合，再加入800 μL新鮮TSB培養(yǎng)液，28 ℃培養(yǎng)3.5 h。取出后分別測定各管中噬菌體效價，3.5 h 滴度最高所對應(yīng)的MOI即為最適感染復(fù)數(shù)。

1.2.2 一步生長曲線測定 將噬菌體按最適MOI與宿主菌（維氏氣單胞菌）按1 ∶ 1混合，置于28 ℃培養(yǎng)箱溫育吸附 15 min 后，12 000 r/min離心1 min，去除上清。獲得的沉淀用20 mL 28 ℃預(yù)熱的TSB液體培養(yǎng)基重懸，于28 ℃ 120 r/min 振蕩培養(yǎng)。每隔5 min取樣1次，25 min之后每隔15 min取樣，連續(xù)取樣3.5 h，在4.5 h時最后取1次。每次取500 μL，使用0.45 μm濾膜過濾后獲得的濾液采用雙層瓊脂培養(yǎng)法測定噬菌體效價。以培養(yǎng)時間為橫坐標、噬菌體滴度為縱坐標，繪制一步生長曲線。

1.2.3 熱穩(wěn)定性測定 將噬菌體原液稀釋至5×107 PFU/mL 并分裝于2 mL離心管中，分別放置于30、40、50、60 ℃的恒溫水浴鍋中，每隔20 min測定各管噬菌體的滴度，至100 min停止檢測，測定噬菌體的耐受溫度和耐受時間。

1.2.4 pH值穩(wěn)定性 以TSB培養(yǎng)液為介質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值為4、5、6、7、8、9、10、11。取滴度為5×108 PFU/mL的噬菌體原液100 μL，加入到900 μL不同pH值的TSB培養(yǎng)液中，28 ℃水浴2 h后測定各管噬菌體的滴度，并計算噬菌體的最適pH值范圍。

1.2.5 氯化鎂促進噬菌體感染的最佳濃度 在各10 mL培養(yǎng)基中加入100 μL宿主菌（維氏氣單胞菌）1×108 CFU/mL，37 ℃搖床培養(yǎng)3 h。然后加入1×108 PFU/mL的噬菌體原液100 μL，及不同終濃度氯化鎂（0、2、4、8、16、32 mmol/L），作用30 min后置于37 ℃搖床培養(yǎng)4 h，取出后分別測定各管中噬菌體效價。

1.2.6 噬菌體對水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的噬菌作用 采用滴注法觀察噬菌體的噬菌效果。滴注法是首先配制2% TSB瓊脂培養(yǎng)基融化后鋪平培養(yǎng)皿底層，凝固后為固體培養(yǎng)基。用涂布法將宿主菌涂滿這個平板，待平板表面風(fēng)干3～5 min后，再在平板上滴加5 μL噬菌體液，28 ℃培養(yǎng)過夜，觀察噬菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適感染復(fù)數(shù)（MOI）

取不同感染復(fù)數(shù)的噬菌體和維氏氣單胞菌，MOI分別為1 000、100、10、1、0.1、0.01和0.001，培養(yǎng)3.5 h后測得相應(yīng)的噬菌體滴度。結(jié)果顯示，該噬菌體感染復(fù)數(shù)為1、10、100、1 000、0.001時，噬菌體滴度較低，在0.1、0.01時，噬菌體滴度較高（圖1），表明NTHP01對于維氏氣單胞菌的最適感染復(fù)數(shù)為0.01。

2.2 一步生長曲線

按最適感染復(fù)數(shù)0.01將噬菌體與維氏氣單胞菌混合，通過離心、沉淀、振蕩培養(yǎng)等操作后，取樣4.5 h，采用雙層瓊脂培養(yǎng)法測定濾液中噬菌體效價，獲得的一步生長曲線（圖2）。結(jié)果顯示，該噬菌體在前150 min未有明顯增長，而在 150 min 開始至210 min爆發(fā)性增加，之后進入了平穩(wěn)期。結(jié)果表明，噬菌體NTPH01對于維氏氣單胞菌的潛伏期和裂解期分別為150、60 min。

2.3 熱穩(wěn)定性

對不同溫度下作用時間與噬菌體滴度的常用對數(shù)作圖。結(jié)果（圖3）顯示，該噬菌體在30～40 ℃區(qū)間內(nèi)，噬菌體滴度均在106 PFU/mL以上，相比較原始滴度107 PFU/mL并未明顯降低，整體上存活率高。溫度達到50 ℃及以上時，該噬菌體在20 min內(nèi)快速失活，20 min時滴度只有105 PFU/mL，當時間在100 min時，50 ℃噬菌體滴度僅為104 PFU/mL，大部分死亡，表現(xiàn)出該噬菌體對50 ℃以上的溫度高度敏感，活性較低。

2.4 pH穩(wěn)定性

噬菌體NTHP01在pH值為7～10的條件下，滴度保持在107 PFU/mL以上，與初始滴度保持一致，即噬菌體在此pH值區(qū)間保持較高的生物活性（圖4），且在pH值為7時活性最高。pH值小于7或大于10時，隨著酸性或堿性增強，噬菌體活性逐漸下降，但總體還保持著較好的活性。

2.5 氯化鎂促進對噬菌體感染的最佳濃度

不同濃度氯化鎂對噬菌體感染影響的結(jié)果顯示，添加氯化鎂的噬菌體滴度明顯高于未添加，且在氯化鎂終濃度為 4 mmol/L 時，促進噬菌體對宿主菌的感染作用最佳（圖5）。在氯化鎂終濃度低于4 mmol/L，隨著氯化鎂濃度的增加而增高;當加入的氯化鎂終濃度大于4 mmol/L時，隨著氯化鎂濃度的增加，促進作用減弱。

2.6 噬菌體對水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的噬菌作用

針對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病菌進行噬菌體噬菌試驗，結(jié)果表明，噬菌體NTHP01對大多數(shù)常見的病原菌均具有較好的裂解作用（表2）。由圖6-A和圖6-B可知，溫和氣單胞菌和腐敗希瓦菌滴加噬菌體后，可見明顯的噬菌斑，說明該噬菌體對這些細菌均有較好的裂解效果。

3 討論

本研究測定了噬菌體NTHP01的最適感染復(fù)數(shù)為0.01，潛伏期和暴發(fā)期分別為150、60 min，為后續(xù)噬菌體的大量制備提供了理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體的一般溫度在20～40 ℃ 之間，呈弱堿性。對該噬菌體熱穩(wěn)定性及pH值穩(wěn)定性進行了試驗，發(fā)現(xiàn)該噬菌體在30～40 ℃之間內(nèi)能夠保持較好的穩(wěn)定性及活性，并在酸堿環(huán)境中表現(xiàn)出較好的適應(yīng)性。

該研究表明，噬菌體NTHP01可以很好地適應(yīng)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用具有極大的可能性。

噬菌體作為細菌的天敵，具有見效快、無毒害、無污染的特點，受到人們的高度關(guān)注[7]。1999年，Nakai等通過黃尾魚的對照實驗研究發(fā)現(xiàn)口服或者注射PLgY-16噬菌體可以有效提高黃尾魚的存活率[8]。2003年，Park等在噬菌體治療試驗中，分別給香魚飼喂含變形假單胞菌飼料（107 CFU/尾），然后喂分別含有PPpW-3、PPpW-4、PPpW-3/W-4噬菌體的飼料（107 CFU/尾），發(fā)現(xiàn)死亡率分別為53.3%、40.0%、20.0%，而對照組死亡率為93.3%，表明PPpW-3/W-4噬菌體能夠有效地降低由變形假單胞菌引起的魚類病變、死亡[9]。2007年，Karunasagar等從牡蠣組織和蝦孵化場分離出4個噬菌體，對其中2個進一步研究發(fā)現(xiàn)可以有效降低哈維氏菌群。在孵化場試驗中，2×106 PFU/mL的噬菌體處理可以使蝦幼蟲存活率超過85%[10]。2013年，Jun等分離出pAh1-C和pAh6-C這2株噬菌體，發(fā)現(xiàn)對魚類致病性嗜水氣單胞菌均顯示出有效的溶菌活性，并且測得潛伏期約 30 min（pAh1-C）和20 min（pAh6-C），裂解數(shù)量為60 PFU/細胞（pAh1-C）和10 PFU/細胞（pAh6-C）[11]。本研究分離得到的噬菌體NTHP01對多種病原菌具有良好的裂解作用，通過雙層平板法和滴注法發(fā)現(xiàn)該噬菌體能夠有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的大多數(shù)致病菌，如副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、變形假單胞菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌等，并形成明顯的噬菌圈。噬菌體NTHP01的寬譜性顯示，它在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較為廣泛的應(yīng)用前景，為水產(chǎn)健康生態(tài)養(yǎng)殖、保障水產(chǎn)品安全及抗生素減量使用提供了新的技術(shù)手段。

綜上所述，噬菌體NTHP01噬菌譜寬，對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的大多數(shù)致病菌具有較好的抑制作用，為噬菌體作為替代抗生素在水產(chǎn)病防控中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。通過分析掌握噬菌體的理化特征，為后續(xù)規(guī)?；苽涮峁┝死碚撘罁?jù)，為該噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Bebak-Williams J，Bullock G，Carson M C. Oxytetracycline residues in a freshwater recirculating system[J]. Aquaculture，2002，205（3）：221-230.

[2]Hu M H. Application of antibiotics in aquaculture，problems and countermeasures[J]. Fisheries Science & Technology Information，2006，33（5）：217-221.

[3]Bruttin A，Brussow H. Human volunteers recciving Escherchia coil

phage T4 orally：a safety test of phase therapy[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，49（7）：2874-2878.

[4]Yang Y H，Le S. Progress on Pseudomonas aeruginosa bacteriophage therapy[J]. Chinese Journal of Antibiotics，2017，42（10）：814-820.

[5]Bao H D，Zhang H，Zhou Y，et al. Study on bactericidal effect and the kinetics of phage cocktail JS-SP1 against mixed epidemic Salmonella strains[J]. Chinese Journal of Antibiotics，2017，42（10）：858-864.

[6]宋增福，徐華東，彭孟凡，等. 兩株副溶血弧菌烈性噬菌體的分離鑒定[J]. 水生生物學(xué)報，2017（4）：793-799.

[7]Li Z，Zhang J C，Cao Z H，et al. The development of bacteriophage control of pathogenic bacteria in aquaculture[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2015（8）：138-143.

[8]Nakai T，Sugimoto R，Park K H，et al. Protective effects of bacteriophage on experimental Lactococcus garvieae infection in yellowtail[J]. Diseases of Aquatic Organisms，1999，37（1）：33-41.

[9]Park S C，Nakai T. Bacteriophage control of Pseudomonas plecoglossicida infection in ayu Plecoglossus altivelis[J]. Diseases of Aquatic Organisms，2003，53（1）：33-39.

[10]Karunasagar I，Shivu M M，Girisha S K，et al. Biocontrol of pathogens in shrimp hatcheries using bacteriophages[J]. Aquaculture，2007，268（1/2/3/4）：288-292.

[11]Jun J W，Kim J H，Shin S P，et al. Protective effects of the Aeromonas phages pAh1-C and pAh6-C against mass mortality of the cyprinid loach （Misgurnus anguillicaudatus） caused by Aeromonas hydrophila[J]. Aquaculture，2013，416：289-295.吳楊平，陳愛華，張 雨，等. 大竹蟶養(yǎng)殖及生長模型研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：135-137.