白羽　丁海麥　石松利

摘要：為利用SRAP技術(shù)研究蒙古扁桃資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)和種質(zhì)資源鑒定，利用正交試驗(yàn)法L16（45）正交設(shè)計(jì)，對(duì)影響蒙古扁桃SRAP-PCR反應(yīng)體系的Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶量、引物濃度4個(gè)因素以及模板DNA濃度進(jìn)行篩選。優(yōu)化的蒙古扁桃SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系為Mg2+濃度為2.5 mmol/L，dNTPs濃度為 0.25 mmol/L，模板DNA濃度為100 ng，Taq酶濃度為2.00 U，引物濃度1.0 μmol/L，2.5 μL 10×PCR buffer，總體積為25 μL。篩選結(jié)果表明，對(duì)蒙古扁桃SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果影響最大的是Taq聚合酶濃度，最小的是dNTPs濃度。運(yùn)用該體系對(duì)144個(gè)隨機(jī)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，篩選出12個(gè)條帶清晰、多態(tài)性高的引物組合，為蒙古扁桃種質(zhì)資源的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蒙古扁桃;分子標(biāo)記;SRAP;正交試驗(yàn);反應(yīng)體系;優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S567.1+90.24? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0046-03

蒙古扁桃是薔薇科李屬的多年生木本植物[1]，是傳統(tǒng)的中藥材，種仁可入藥，主治干咳、陰虛便秘等病癥。蒙古扁桃為亞洲中部戈壁地區(qū)特有的旱生種類，分布于我國(guó)的戈壁荒漠草原區(qū)[2]，是國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物[3]。近年來(lái)蒙古扁桃的研究主要體現(xiàn)在生理[4-5]、藥理性[6-7]、組織培養(yǎng)[8-10]、有效成分鑒定分離[11-13]等方面，但對(duì)于蒙古扁桃資源的遺傳多樣性研究和種質(zhì)資源鑒定仍不多。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，簡(jiǎn)稱SRAP）是一種以PCR標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)重復(fù)性高、簡(jiǎn)便、快速，以廣泛應(yīng)用于藥用植物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性研究、指紋圖譜和親緣關(guān)系等方面的研究。本研究利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)蒙古扁桃SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，分析SRAP-PCR反應(yīng)體系中各因素的相互影響[14]，得到最佳優(yōu)化的組合，并對(duì)144對(duì)引物進(jìn)行了SRAP-PCR分子標(biāo)記，篩選一些多態(tài)性高的引物組合，為進(jìn)一步研究蒙古扁桃種質(zhì)資源和遺傳多樣性打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料 所選材料為蒙古扁桃的種仁，采集于阿拉善諾日公。

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶，CTAB，MgCl2，dNTPs，10×PCR Buffer（Mg2+free），參照Li等發(fā)表的SRAP引物[15]設(shè)計(jì)12條正向引物、12條反向引物，均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成;離心機(jī)（飛鴿，上海安亭科學(xué)儀器廠）;微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Nano Drop）;凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）;PCR儀（Biometra公司）;電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取及檢測(cè) 以蒙古扁桃的種仁為材料，利用改良的CTAB法提取基因組的DNA，DNA干燥風(fēng)干后溶解沉淀于1×TE溶液中，并采用微量紫外分光光度計(jì)及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)供試DNA的純度和濃度。

1.2.2 SRAP-PCR體系的優(yōu)化 利用L16（45）正交設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)試驗(yàn)，對(duì)DNA模板濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶濃度和dNTP濃度，進(jìn)行5因素4水平篩選（表1）。

1.2.3 SRAP-PCR擴(kuò)增程序 制備總體積為25 μL的SRAP-PCR反應(yīng)體系，除表中變化因素外，每管中加入10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，其余的補(bǔ)加ddH2O。模板為采集于趙長(zhǎng)城的蒙古扁桃種仁DNA，所選用的引物組合為F5+R7，引物序列見(jiàn)表2。SRAP-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min30 s，5個(gè)循環(huán);94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。依照條帶多少及條帶強(qiáng)弱做1～16積分，分?jǐn)?shù)越高，表明特異性、敏感性好。

1.2.4 優(yōu)化體系的檢測(cè) 根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果確定SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系，從預(yù)篩選引物中隨機(jī)選取引物組合，對(duì)5個(gè)不同居群的樣品DNA進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，檢測(cè)優(yōu)化的SRAP-PCR體系及擴(kuò)增程序的穩(wěn)定性。

1.2.5 引物篩選 根據(jù)SRAP的正向引物12條，反向引物12條，隨機(jī)組成144對(duì)引物組合，采用優(yōu)化的SRAP-PCR組合，對(duì)采集于趙長(zhǎng)城地的蒙古扁桃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖檢測(cè)，從而選擇出多態(tài)性高的引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

利用改良的CTAB法提取蒙古扁桃種仁DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，結(jié)果顯示DNA條帶清晰，無(wú)降解，表明DNA完整（圖1）。通過(guò)紫外分光光度計(jì)對(duì)蒙古扁桃種仁DNA樣品濃度進(jìn)行檢測(cè)，D260 nm/D280 nm比值在1.80～1.95之間，說(shuō)明經(jīng)改良的CTAB法提取DNA的提取質(zhì)量較高，滿足PCR的要求。

2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)主要條帶的多少、清晰度打分，效果最佳16，最差的1分，各體系得分依次為1、12、14、4、2、6、6、8、2、1、15、15、2、16、3、14。從電泳結(jié)果可以看出，第3、11、12、14泳道的主條帶清晰且多，副條帶明顯，表明這幾個(gè)組合多態(tài)性高，都可以作為蒙古扁桃正交試驗(yàn)組合，但從經(jīng)濟(jì)性考慮，最后選擇第3組作為蒙古扁桃SRAP-PCR最佳反應(yīng)組合。直觀分析12個(gè)組合的條帶數(shù)，5因素間各水平具有不同顯著性，對(duì)擴(kuò)增效果的影響順序依次為T(mén)aq DNA聚合酶>引物>Mg2+>模板DNA>dNTPs。即在25 μL體系中，2.00 U/mL Taq酶，1.0 μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2、0.25 mmol/L dNTPs、100 ng模板DNA是最佳反應(yīng)體系。

2.3 體系優(yōu)化穩(wěn)定性的檢測(cè)

根據(jù)上述正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系，利用F6/R9引物組合，對(duì)5份不同種質(zhì)材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果見(jiàn)圖2，條帶清晰且多，特異性強(qiáng)，能夠區(qū)分5種蒙古扁桃種質(zhì)，表明該試驗(yàn)優(yōu)化的SPAP-PCR反應(yīng)體系能夠有效地用于蒙古扁桃遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定等方面。

2.4 多態(tài)性引物組合的篩選結(jié)果

應(yīng)用優(yōu)化后的SRAP反應(yīng)體系，用12條上游引物、12條下游引物組成的144對(duì)引物組合對(duì)蒙古扁桃樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并篩選多態(tài)性好、條帶清晰、重復(fù)性好的結(jié)果進(jìn)行分析。最終從144對(duì)引物中篩選出12對(duì)多態(tài)性好、條帶清晰的引物組合，分別為F1/R22、F2/R22、F3/R6、F4/R7、F5/R7、F6/R9、F7/R9、F8/R6、F9/R5、F10/R3、F11/R3、F12/R7。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

3 討論與結(jié)論

SRAP是一種新型的基于PCR反應(yīng)的分子標(biāo)記，不但具有擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)，而且還快速簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。然而，反應(yīng)體系中各因素水平濃度不同會(huì)對(duì)SRAP分子標(biāo)記的結(jié)果產(chǎn)生影響，并且不同的植物對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系的要求也各不相同[16]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化體系與傳統(tǒng)的單因素體系優(yōu)化方法相比，優(yōu)點(diǎn)在于考慮到了試驗(yàn)中各反應(yīng)條件間的相互影響，能迅速找到理想中的引物組合。因而，對(duì)體系的優(yōu)化是進(jìn)行SRAP反應(yīng)的關(guān)鍵。正交優(yōu)化設(shè)計(jì)一般采用的主觀打分手段，易造成結(jié)論偏差，本試驗(yàn)利用了凝膠成像系統(tǒng)Gel-Pro Analyzer4圖像處理軟件，對(duì)SRAP-PCR建立起客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，更好地促進(jìn)正交優(yōu)化的應(yīng)用。

本試驗(yàn)建立的適合蒙古扁桃的SRAP反應(yīng)體系為模板DNA濃度為100 ng，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，Taq酶濃度為2.00 U，引物濃度1.0 mmol/L、dNTPs濃度為0.25 mmol/L，2.5 μL 10×PCR buffer，剩余用ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。同時(shí)，本試驗(yàn)利用該體系從隨機(jī)組成的144對(duì)引物組合中篩選出12對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性高、條帶清晰的引物組合，為后續(xù)研究蒙古扁桃種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)，也為用SRAP分子標(biāo)記法研究蒙古扁桃種質(zhì)遺傳多樣性、親緣關(guān)系等方面提供了依據(jù)。

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