剛地弓形蟲(T.gondii)是一種專性有核細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，其存在廣泛的中間宿主群，包括人類。貓科動物為其終宿主。全球已經(jīng)有30%的人口被弓形蟲感染，歐美部分國家甚至高達(dá)40%[2]，我國某些地區(qū)人群血清學(xué)陽性率約7%[3]。此外，弓形蟲病給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的損失。弓形蟲感染多為隱性感染期，免疫力正常的感染者無臨床表現(xiàn)，或呈輕度一過性臨床癥狀。但是免疫功能低下的感染者，可出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，例如弓形蟲腦炎、肺炎、脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎等，甚至致死[4]。已知弓形蟲棒狀體分泌的可溶性蛋白(ROP)參與蟲體侵襲、增殖、播散及免疫逃逸等。ROP在不同的基因型蟲株具有多態(tài)性。I型和III型弓形蟲的具有激酶活性的ROP16I/III可磷酸化State 3/6，早期感染驅(qū)動巨噬細(xì)胞向M2極化，可使蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，易導(dǎo)致蟲體在全身播散甚至致宿主死亡[5]。研究表明，我國的弓形蟲的優(yōu)勢基因型為Chinese 1，WH3株和WH6株是毒力截然不同的二個蟲株，感染Chinese 1 型WH3株的ROP16缺陷株可以活化Th1和Th17細(xì)胞，顛覆母-胎界面以Th2優(yōu)勢應(yīng)答為主的免疫偏移，引起滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，可導(dǎo)致不良妊娠[6]。研究發(fā)現(xiàn)，I型ROP16基因敲除株導(dǎo)致弓形蟲在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖速度高于野生株，但是感染小鼠的死亡率并沒有降低，提示ROP16并非是早期致死小鼠的關(guān)鍵毒力因子[7]。本課題組前期利用CRISPR-Cas9 技術(shù)，成功獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)RH株ROP16I/III基因缺陷蟲株[7]。在此基礎(chǔ)上，本研究將體外培養(yǎng)的ROP16I/III基因缺陷蟲株腹腔接種BALB/c小鼠，動態(tài)觀察感染小鼠的急性期臨床發(fā)病、腦等組織切片病理及檢測脾細(xì)胞炎性因子水平，旨在深入研究效應(yīng)分子ROP16I/III在急性期致病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1弓形蟲type I型RH株及RHΔROP16株 由本實驗室傳代保存，復(fù)蘇后腹腔接種小鼠。

1.1.2實驗動物 雌性6～8周齡SPF級BALB/c小鼠(20～25 g)，由濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。

1.1.3實驗試劑 諾唯贊 SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒、 Hi Script ‖QRT Super Mix for q PCR均購于合肥颯英斯生物公司。氯仿、異丙醇、無水乙醇、4%多聚甲醛均購于安徽欣樂生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1BALB/c小鼠速殖子接種 分別收集RH野生型和RHΔROP16速殖子，顯微鏡下計數(shù)并稀釋至1 000個/mL，每組20只小鼠，每只腹腔注射400 μL，觀察并記錄小鼠出現(xiàn)豎毛、弓背、腹水及活動遲緩的先后順序及死亡時間。分別在感染后3 d、5 d和7 d，麻醉狀態(tài)下，剖殺小鼠取脾臟組織，-80 ℃冰箱保存、備用。

1.2.2腦組織和肺組織HE染色 分別于感染后3 d、5 d和7 d，每組隨機(jī)取5只小鼠，無痛麻醉下眼球取血后脫頸處死，分別取腦組織和肺組織，置4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋，3 μm切片。切片置于65 ℃烤箱過夜，次日置于二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，置于蘇木精染液3 min，1%鹽酸乙醇分化后水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3脾組織總RNA提取 從-80 ℃冰箱取出脾組織，用剪刀剪碎后加入 300 μL Trizol用勻漿機(jī)硏磨后再加入700 μL Trizol，提取RNA并測定濃度及純度。按照Hi Script QRT Super Mix for qPCR說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

1.2.4細(xì)胞因子引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank中Arg-1、IL-10、IL-12p40、IFN-γ和TNF-α的序列，用Premier 3設(shè)計引物，上海生工生物工程有限公司合成。

Target Primer sequence(5′-3′)

Arg-1 F: CAGAAGAATGGAAGAGTCAG

R: CAGATATGCAGGGAGTCACC

IFN-γ F: GGTCAACAACCCACAGGTCC

R: CGACTCCTTTTCCGCTTCC

IL-10 F: GCTCCTAGAGCTGCGGACT

R: TGTTGTCCAGCTGGTCCTTT

TNF-α F: ACGGCATGGATCTCAAAGAC

R: GTGGGTGAGGAGCACGTAGT

IL-12 F: GATGTCACCTGCCCAACTG

R: TGGTTTGATGATGTCCCTGA

GAPDH F: CAACTTTGGCATTGTGGAAGG

R: ACACATTGGGGGTAGGAACAC

1.2.5細(xì)胞因子測定 按照SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒說明書20 μL體系，利用羅氏LC96 SW 1.1相對定量檢測脾臟細(xì)胞因子變化。

1.3野生型RH和RHΔrop16株在小鼠體內(nèi)增殖測定

取6只8周雌性小鼠，每組3只，分別腹腔注射1 200個蟲株，于第5 d無痛脫頸處死，腹腔灌洗計數(shù)蟲株數(shù)量。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism 6.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用t檢驗方法分析，檢驗水平為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1野生型RH株和RHΔrop16感染小鼠臨床表現(xiàn) 通過腹腔注射相同數(shù)量的速殖子建立RHΔrop16和野生型感染鼠模型，動態(tài)觀察二組鼠于感染3 d、5 d、6 d、7 d、8 d小鼠發(fā)病(見表1)。

表1 RHΔrop16小鼠和RH小鼠弓形蟲病癥狀

Tab.1 Mice infected with wild-type RH strain and RHΔrop16strain checked for clinical signs of toxoplasmosis

Group(n=3)Daysafterinjectionoftachyzoites3d5d6d7d8dcontrolNoobvioussymptomsNoobvioussymptomsNoobvioussymptomsNoobvioussymptomsNoobvioussymptomsRHNoobvioussymptomskyphosis,piloerec-tion,asmallamountofasciteskyphosis,piloerec-tion,scites,deathkyphosis,piloerec-tion,scites,deathAlldeathΔROP16Noobvioussymptomskyphosis,piloerec-tion,asmallamountofasciteskyphosis,piloerec-tion,asmallamountofasciteskyphosis,piloerec-tion,scites,deathAlldeath

2.2RHΔrop16和野生型RH株感染小鼠存活率 兩組動物存活率無差異。 野生型RH感染組第6 d開始出現(xiàn)死亡，RHΔROP16感染組小鼠第7 d開始出現(xiàn)死亡，但兩組均在第8 d死亡，統(tǒng)計學(xué)分析兩組小鼠存活率之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見圖1)。

圖1 感染野生型RH蟲株和RHΔrop16蟲株小鼠的存活率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)Fig.1 Survival curve of mice infected wild-type RH strains and RHΔrop16 strains(P>0.05)

2.3野生型RH株和RHΔrop16感染小鼠組織病理檢查

2.3.1肺組織切片HE染色顯示感染后3 d可見炎性細(xì)胞廣泛浸潤、間質(zhì)細(xì)胞輕度增生，部分肺泡內(nèi)可見淤血。感染后第5 d可見廣泛炎性細(xì)胞浸潤、肺毛細(xì)血管充血明顯，肺間質(zhì)細(xì)胞明顯增生、肺泡壁增厚，部分肺泡腔閉塞，重度肺水腫、肺泡間隔破裂，感染7 d肺嚴(yán)重淤血、水腫，兩者未見明顯差異(見圖2)。

2.3.2腦組織切片HE染色顯示兩組小鼠感染后3 d腦間質(zhì)均表現(xiàn)輕度疏松、水腫；隨著感染時間的延長，腦組織間質(zhì)疏松、水腫漸趨嚴(yán)重，可見膠質(zhì)細(xì)胞變性及壞死。感染后第7 d，野生型RH感染小鼠腦組織局部可見大量小細(xì)胞增生浸潤(見圖3)，而同期RHΔrop16感染小鼠未見異常增生，感染野生蟲株的宿主腦組織病變更嚴(yán)重。

2.4野生型RH株和RHΔrop16在小鼠體內(nèi)增殖RHΔrop16和野生型RH株在小鼠體內(nèi)增殖無統(tǒng)計學(xué)差異(t=2.449,P>0.05)(見圖4)。

圖4 野生型和ROP16缺陷型蟲株在小鼠體內(nèi)增殖無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)Fig.4 Tachyzoite proliferation rate in penitoneal cavity of mice infected with wild-type RH strain and RHΔrop16 strain in vivo(P>0.05)

2.5野生型RH株和RHΔrop16感染小鼠脾臟Arg-1、IL-10、IL-12和TNF-α mRNA表達(dá) 為研究ROP16I/III基因缺陷蟲株感染宿主體內(nèi)炎性免疫應(yīng)答的特征，qRT-PCR檢測脾細(xì)胞炎性因子及抑炎因子水平。結(jié)果表明， RHΔrop16株感染鼠脾臟Arg-1 mRNA水平明顯低于野生型RH株感染鼠(t3d=2.417,t5d=3.525,t7d=4.863,P均<0.05)。兩株弓形蟲感染鼠脾臟IL-10、IL-12和TNF-α mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(IL-10:t3d=2.319,t5d=1.481,t7d=0.911;IL-12:t3d=0.200,t5d=0.589,t7d=1.315;TNF-α:t3d=1.833,t5d=1.313,t7d=1.969;IFN-γ:t3d=0.669,t5d=1.473,t7d=1.664;P均>0.05)(見圖5)。

圖2 感染野生型RH株和RHΔrop16株小鼠肺部組織病理學(xué)改變Fig.2 Histopathological lesions in the lung of mice infected with wild-type RH strain and RHΔrop16 strain with H&E staining(×200)

圖3 感染野生型RH株和ROP16缺陷蟲株小鼠腦部組織病理學(xué)改變Fig.3 Histopathological changes in the brain of mice infected with wild-type RH strain and RHΔrop16 strain with H&E staining(×200)

圖5 野生型蟲株感染的小鼠ARG-1明顯高于敲除株(P<0.05);IL-10、IFN-γ、IL-12、TNF-α無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)Fig.5 Levels of Arg-1,IL-10,IFN-γ,IL-12 and TNF-α mRNA detected by qRT-PCR. Mice (n=3/ group) infected with wild-type RH strain and RHΔrop16 strain

3 討 論

剛地弓形蟲是一種重要的人獸共患性寄生蟲。已知世界流行的弓形蟲主要分為I、 II和 III型。本實驗室報道，中國大陸人獸間流行的弓形蟲基因型為Chinese 1型(代表蟲株Wh3、Wh6)等[7]。弓形蟲的毒力與某些棒狀體蛋白有關(guān)。I型和III型蟲株的ROP為ROPI/III(L503)；而II型蟲株為ROPII(S503)。ROPI/III直接磷酸化Stat3/6信號通路，在感染早期驅(qū)動巨噬細(xì)胞向M2極化，有利于蟲體的大量增殖，導(dǎo)致宿主體內(nèi)全身播散甚至導(dǎo)死亡[9]。小鼠在感染急性期死亡；而ROPII則無此活性[10]。相反，另一蟲源性效應(yīng)分子GRA15I/III無激酶活性，但GRA15II則可活化NF-Κb，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化，誘導(dǎo)早期的固有免疫應(yīng)答發(fā)揮抗蟲作用。我國的Chinese 1基因型蟲株同時攜帶ROPI/III和GRA15II[11]，提示其具有獨特的毒力和致病機(jī)制。

為了證實I型以及Chinese 1型蟲株ROP16I/III與蟲株致病性關(guān)系，本課題建立ROP16I/III基因缺陷蟲株感染BALB/c小鼠模型，體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，RHΔrop16蟲株較野生型蟲株感染的小鼠，M2極化的標(biāo)志分子Arg-1明顯減少，提示ROP16I/III促進(jìn)了Arg-1的表達(dá)，但是蟲株對小鼠的毒力并未見明顯減弱，表現(xiàn)為小鼠弓背、豎毛、腹水等弓形蟲病癥狀、生存率及宿主體內(nèi)增殖無統(tǒng)計學(xué)差異。此外，RHΔrop16組小鼠IL-10表達(dá)量未見顯著變化，可能在體內(nèi)弓形蟲不僅感染巨噬細(xì)胞，還可感染DC、Th0、以及NK細(xì)胞等其他免疫相關(guān)細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞均可分泌IL-10。以上結(jié)果提示，I型以及Chinese 1型蟲株的ROP16I/III雖然參與負(fù)向調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞并促進(jìn)蟲體在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖，但其并非唯一的毒力因子。不同基因型弓形蟲及其毒力/效應(yīng)分子在弓形蟲病發(fā)病機(jī)制中的作用，尚待深入研究。

利益沖突：無

引用本文格式：何佳麗，陳守斌，崔雯，等.弓形蟲RH株ROP16I/III基因缺陷蟲株感染BALB/c鼠的致病性研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2019，35(7)：620-625. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.61