洪 捷，曹 陽2，談忠鳴，錢慧敏，董 晨，顧 玲，孔筱筱，周 璐

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是導(dǎo)致社區(qū)感染和院內(nèi)感染的一種重要病原菌。SA廣泛分布于健康人的皮膚表面和鼻咽等部位，并可感染人引起多種侵襲性疾病和毒素性疾病[1]?？股厥侵委熂?xì)菌感染的主要藥物，但隨著抗生素廣泛使用，SA對各類抗生素的敏感性逐漸降低。在我國，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)檢出率較高，最高占SA感染總數(shù)的50%以上[2]。多數(shù)MRSA對目前臨床應(yīng)用的絕大多數(shù)抗生素均耐藥，且其感染長發(fā)生于免疫缺陷、大面積燒傷、大手術(shù)后及老年患者，容易造成流行和暴發(fā)，病死率可高達(dá)50%。

SA對不同的抗生素有不同的耐藥機(jī)制，對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥,主要通過mec基因復(fù)合體調(diào)控合成新的青霉素結(jié)合蛋白以及合成β-內(nèi)酰胺酶阻止藥物到達(dá)作用靶點(diǎn)兩種方式[3]； 對于四環(huán)素類藥物耐藥，主要通過tetM基因加速藥物自核糖體解離以及tetK基因編碼外排泵蛋白加速藥物外排的方式來實現(xiàn)[4]；對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥,主要通過erm基因修飾靶位核糖體而阻止藥物與之結(jié)合、產(chǎn)生滅活酶滅活大環(huán)內(nèi)酯類抗生素以及esr基因調(diào)控加速藥物泵出的方式[5]。

本文通過研究2017年全省范圍內(nèi)收集的227株金黃色葡萄球菌，檢測其對15種抗生素的耐藥性，檢測7種耐藥基因的攜帶率，同時采用MLST方法對金葡菌進(jìn)行分子分型，分析不同地區(qū)、不同來源的金葡菌的耐藥性、耐藥機(jī)制和分子流行病之間的特征關(guān)系。

1 材料與方法

1.1對象 本研究中的227株金黃色葡萄球菌均為2017年通過國家致病菌識別網(wǎng)收集，菌株來自全省13個設(shè)區(qū)市的26家哨點(diǎn)醫(yī)院，其中蘇中地區(qū)40株，蘇北地區(qū)87株，蘇南地區(qū)100株，藥敏質(zhì)控株糞腸球菌ATCC29212和金黃色葡萄球菌ATCC29213均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 方 法

1.2.1藥物敏感性檢測 采用微量肉湯稀釋法檢測金葡菌對抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。檢測使用的藥敏板為商品化的致病菌識別網(wǎng)定制板條，檢測的抗生素包括苯唑西林、頭孢西丁、青霉素、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素、替考拉寧、慶大霉素、左氧氟沙星、利福平、復(fù)方新諾明、達(dá)托霉素、利奈唑胺和呋喃妥因，藥敏板購自上海星佰生物科技有限公司。藥敏結(jié)果判讀根據(jù)美國國立臨床標(biāo)準(zhǔn)實驗室委員會(CLSI)2018 M100手冊要求。

1.2.2DNA提取 將菌株接種于營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，挑取足量的菌落重懸于無菌的生理鹽水中，然后使用商品化的核酸提取試劑盒(QIAamp○RDNA Mini Kit)提取DNA。

1.2.3耐藥基因檢測 甲氧西林耐藥基因(mecA)、四環(huán)素耐藥基因(tetK、tetM)、紅霉素耐藥基因(ermA、ermB、ermC)、克林霉素耐藥基因(linA)的引物序列參照文獻(xiàn)[6-7]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，90 V，50 min在凝膠成像儀下判讀結(jié)果。

1.2.4MLST分子分型 7個管家基因(arcC、aroE、glpF、gmK、pta、tpi、yqiL)的引物序列參照金黃色葡萄球菌MLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/saureus/)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果上傳到金黃色葡萄球菌MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線分析，獲取每個菌株7個管家基因的等位基因編號(allelic profile)，根據(jù)等位基因編號得出序列型(Sequence type，ST)。與數(shù)據(jù)庫比對后數(shù)據(jù)庫中沒有的ST型，則為新發(fā)現(xiàn)的ST型。最后根據(jù)已獲得的ST型使用eBURST分析軟件進(jìn)行聚類分析。

1.3數(shù)據(jù)處理 將數(shù)據(jù)錄入SPSS24.0系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析，分類資料采用卡方檢驗，非參數(shù)資料采用秩和檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義?？ǚ椒指畈捎肂onferroni校正P值。

2 結(jié) 果

2.1金葡菌的標(biāo)本來源 2017年1月至12月，共收集227株金黃色葡萄球菌，其中分離自無菌部位樣本67株(包括血液、腦脊液等)，占29.5%，分離自開放部位樣本160株(包括分泌物、膿液、糞便、痰液等)，占70.5%。

2.2金葡菌耐藥性 227株金黃色葡萄球菌對青霉素、紅霉素、頭孢西丁、苯唑西林、克林霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素、慶大霉素的耐藥率較高，而對替考拉寧、利福平、復(fù)方新諾明、達(dá)托霉素、利奈唑胺以及呋喃妥因多呈敏感，耐藥率均低于10%，且所有菌株均對萬古霉素敏感。所有菌株的具體耐藥情況見表1。

227株金葡菌中，耐三類以上抗生素的菌株，即多重耐藥菌株98株，占43.1%。有1株對10種抗生素耐藥，對全部15種抗生素均敏感的菌株有10株。

表1 金黃色葡萄球菌的耐藥性

Tab.1 Drug resistance ofStaphylococcusaureus

抗菌藥物耐藥菌株數(shù)(n)耐藥率/%苯唑西林11751.5頭孢西丁12755.9青霉素20891.6四環(huán)素5323.3紅霉素15668.7克林霉素9943.6萬古霉素00替考拉寧73.0慶大霉素4519.8左氧氟沙星7533.0利福平31.3復(fù)方新諾明156.6達(dá)托霉素10.4利奈唑胺20.9呋喃妥因94.0

無菌部位分離的菌株平均耐藥數(shù)為3.82種，開放部位分離的菌株平均耐藥數(shù)為4.12種，兩組菌株在耐藥種數(shù)和不同抗生素耐藥率均不存在統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。蘇北地區(qū)菌株平均耐藥種數(shù)為4.49種，蘇南地區(qū)平均耐藥種數(shù)為3.74種，蘇中地區(qū)平均耐藥種數(shù)為3.75種，蘇北地區(qū)耐藥種數(shù)高于蘇南地區(qū)菌株(Z=-2.206，P=0.027)。且蘇北地區(qū)菌株克林霉素耐藥率要高于蘇中(χ2=5.643，P=0.018)和蘇南地區(qū)(χ2=5.523，P=0.019)。

2.3MRSA與MSSA檢出情況 本研究以更穩(wěn)定的苯唑西林代替甲氧西林，將耐苯唑西林的金葡菌判定為耐甲氧西林金葡菌(MRSA)，共檢出117株MRSA，檢出率為51.5%。

無菌部位標(biāo)本檢出MRSA35株，開放部位標(biāo)本檢出82株，不同部位標(biāo)本MRSA檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=1.109，P=0.292)。蘇北地區(qū)檢出MRSA 45株，蘇中地區(qū)菌株檢出22株，蘇南地區(qū)檢出50株，3個地區(qū)之間MRSA檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.288，P=0.866)。MRSA平均耐藥種數(shù)4.81種(不計算苯唑西林)，甲氧西林敏感金葡菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus, MSSA)平均耐藥種數(shù)2.14種，MRSA耐藥種數(shù)高于MSSA(Z=-11.172，P<0.001)。且MRSA的慶大霉素耐藥率高于MSSA(χ2=5.141，P=0.023)。

2.4耐藥基因攜帶情況 227株金黃色葡萄球菌中，mecA、tetK、tetM、ermA、ermB、ermC、linA耐藥基因的攜帶情況見表2，每株菌平均攜帶耐藥基因1.51個。7種耐藥基因都不攜帶的菌株有51株，共有16株菌最多攜帶4種耐藥基因，最常見的4種耐藥基因攜帶譜為mecA+tetK+ermB+ermC。

表2 耐藥基因攜帶情況

Tab.2 Carriage of durg-resistance genes

耐藥基因菌株數(shù)量(n)攜帶率/%mecA10747.1tetK3214.1tetM219.3ermA3214.1ermB3716.3ermC10144.5linA156.6None5124.2

無菌部位分離的菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)為1.58個，開放部位分離的菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)為1.48個。不同部位分離到的菌株耐藥基因數(shù)不存在統(tǒng)計學(xué)差異(Z=-0.709，P=0.478)。MRSA菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)為2.15個，MSSA菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)為0.83個，MRSA攜帶的耐藥基因數(shù)要高于MSSA(Z=-8.750，P<0.001)。蘇北地區(qū)菌株平均攜帶耐藥基因數(shù)為1.55個，蘇南地區(qū)為1.35個，蘇中地區(qū)為1.80個，蘇中菌株耐藥基因攜帶數(shù)要高于蘇南地區(qū)(Z=-2.048，P=0.041)。

2.5金葡菌MLST分子分型 在227株金葡菌中發(fā)現(xiàn)了60個ST型，其中有29個為新發(fā)現(xiàn)ST型，包含59株菌，占比26.0%。新ST型數(shù)據(jù)信息已經(jīng)上傳數(shù)據(jù)庫并獲得新的ST型編號，分別為ST4842-ST4870。主要ST型分布情況見圖1。

將所有ST型數(shù)據(jù)錄入eBurst軟件進(jìn)行聚類分析，設(shè)定群所需最小相同等位基因數(shù)為6，取樣自展值設(shè)置為1000，結(jié)果見圖2。共有31個ST型分別以ST5，ST59，ST398，ST630和ST4495為節(jié)點(diǎn)聚類成5個簇，分別為CC5、CC59、CC398、CC630和C4495，成簇菌株138株，占比61.7%。

不同標(biāo)本來源、不同地域的菌株主要ST型分布詳見表3。

圖1 主要ST型分布Fig.1 Distribution of major STs

圖2 全部ST型聚類Fig.2 Cluster analysis of all STs

表3 不同標(biāo)本來源、不同地域的菌株主要ST型分布

Tab.3 Distribution of major STs from different isolates and areas

ST型克隆群樣本來源地區(qū)菌株耐藥開放部位無菌部位蘇北蘇中蘇南MRSAMSSAST59CC5925517310255ST398CC398191179141614ST630CC630114087114ST4863?NA104617212

*表示新發(fā)現(xiàn)ST型，NA表示未歸入克隆群

2.6成簇克隆群和金葡菌耐藥特征的相關(guān)性 比較5個簇菌株的耐藥種數(shù)，平均耐藥基因數(shù)，抗生素耐藥率和MRSA檢出率，詳見表4。CC5菌株耐藥種數(shù)高于CC59(調(diào)整P=0.015)、CC398(調(diào)整P<0.001)、CC630(調(diào)整P=0.05)、CC4495(調(diào)整P=0.007)，CC59高于CC398(調(diào)整P=0.002)，CC630高于CC398(調(diào)整P=0.003)。

CC5耐藥基因攜帶數(shù)高于CC59(調(diào)整P<0.001)、CC398(調(diào)整P<0.001)、CC630(調(diào)整P=0.037)、CC4495(調(diào)整P<0.001)，CC59高于CC398(調(diào)整P=0.02),CC630高于CC59(調(diào)整P<0.001),C630高于CC4495(調(diào)整P=0.042)。

CC4495菌株左氧氟沙星耐藥率高于CC59(χ2=9.558，P=0.003)。CC5菌株的MRSA檢出率高于CC398(χ2=14.131，P<0.001)、CC630(χ2=11.216，P=0.001)，CC59高于CC398(χ2=8.122，P=0.004)。

表4 不同簇菌株耐藥相關(guān)特征比較

Tab.4 Comparison of drug-resistance characteristics in different clusters

平均耐藥種數(shù)平均耐藥基因數(shù)左氧氟沙星耐藥率/%MRSA檢出率/%CC56.38a3.24a42.9ab100aCC594.41bc1.90bde17.1a82.9aCC3982.69c1.11ce41.7ab52.8bCC6304.83b2.31d41.4ab69.0bCC44953.55bc1.18e63.6b81.8ab

注：耐藥相關(guān)特征兩兩比較，同列數(shù)字后字母不同表示比較后有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，字母相同表示比較后無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

3 討 論

雖然有研究[8]發(fā)現(xiàn)院內(nèi)MRSA的檢出率近年來呈現(xiàn)下降的趨勢，但是金葡菌的耐藥形勢仍然不容樂觀，本研究發(fā)現(xiàn)臨床分離的多重耐藥金葡菌比例超過40%，MRSA的檢出率也超過50%，檢出率高于黎巴嫩報道的29.5%[9]和我國深圳地區(qū)的26.2%[10]。本研究中的金葡菌對多種抗生素的耐藥結(jié)果與全國多數(shù)地區(qū)沈陽[11]、珠海[12]、廣州[13]等地的臨床分離株耐藥率相近，但在江蘇省內(nèi)的蘇北、蘇中和蘇南地區(qū)分離到的金葡菌菌株在耐藥種數(shù)和克林霉素耐藥率方面均存在差異，提示不同地區(qū)抗生素的使用和管理策略可能會對金葡菌耐藥率產(chǎn)生影響。

本研究中金葡菌mecA和ermC攜帶率較高，均超過40%，與韓玉濤等[14]40.0%的結(jié)果相近，但高于賈珉等[15]的21.7%。而tetM、ermA、ermB攜帶率低于王冬梅等人[16]的研究結(jié)果，但高于安徽[17]報道的耐紅霉素金葡菌的攜帶率。同時本研究結(jié)果提示蘇北、蘇中和蘇南地區(qū)的金葡菌耐藥基因攜帶數(shù)和攜帶率不盡相同，因此推測不同地區(qū)金葡菌對抗生素的主要耐藥機(jī)制并不相同。本研究還檢測了克林霉素耐藥基因linA，陽性率僅為6.6%，遠(yuǎn)低于克林霉素的耐藥率43.6%，推測克林霉素的耐藥以誘導(dǎo)型耐藥為主[18]。

金葡菌目前在MLST數(shù)據(jù)庫中的ST型已經(jīng)超過4 800個，而此次分離的227株金葡菌發(fā)現(xiàn)ST型60個，其中新發(fā)現(xiàn)ST型29個，呈現(xiàn)出較為豐富的種群結(jié)構(gòu)特征。研究[19]發(fā)現(xiàn)ST5和ST239是我國院內(nèi)分離的金葡菌最常見的ST型，在全國多個城市均有分離，同時也是院內(nèi)MRSA的主要型別之一[20], 與之不同的是一項新西蘭[21]的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)豈RSA的主要ST型為ST8、ST93和ST1。而在本研究中所發(fā)現(xiàn)的ST5和ST239均為MRSA，但是MRSA中分布最多的ST型是ST59和ST398，MSSA中分布最多的是ST398和ST4863。而ST59和ST398則多為社區(qū)獲得性MRSA(Community- Associated Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus，CA-MRSA)的主要型別，而荷蘭[22]和德國[23]的研究則認(rèn)為在北美和歐洲ST398-MRSA是家畜相關(guān)MRSA(Livestock-Associated Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus，LA-MRSA)，在家畜和家畜養(yǎng)殖人員身上均有分離[24]，而在亞洲[25]與豬密切相關(guān)的ST型為ST9，但在本次研究中未發(fā)現(xiàn)ST9。 因此，本研究認(rèn)為臨床分離的金葡菌尤其是MRSA，社區(qū)獲得的比例可能要高于院內(nèi)獲得的比例，因此導(dǎo)致感染人的比例也會偏高。同時本省不同地區(qū)分離的菌株在耐藥率和耐藥機(jī)制方面也存在著較為明顯的差異，因此對于預(yù)防控制金葡菌感染，除了院內(nèi)做好感控措施之外，對CA-MRSA應(yīng)當(dāng)予以更多的關(guān)注和監(jiān)測。

利益沖突：無

引用本文格式：洪捷，曹陽，談忠鳴，等.江蘇地區(qū)金黃色葡萄球菌耐藥及分子分型研究[J].中國人獸共患病學(xué)報，2019，35(7)：604-609. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.70